PDTC對肺纖維化模型大鼠肺成纖維細胞影響的研究.pdf

1、本文通過觀察NF-κB抑制劑-二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrodlidinedithiocarbamate，PDTC)對TGF-β1誘導的肺成纖維細胞表達CTGF、α-SMA的影響，探討NF-κB在TGF-β1誘導肺成纖維細胞表達CTGF及肺成纖維細胞向MF分化中的作用。 研究方法： 1.實驗動物和細胞來源選用170-200g雄性SD大鼠，一次性氣管內滴注博萊霉素-A5(bleomycin-A5，BLM-A5，5mg/k

2、g)，第14天取肺組織培養(yǎng)肺成纖維細胞，第4代細胞用于實驗。 2.細胞培養(yǎng)采用組織塊法培養(yǎng)肺成纖維細胞，37℃，濃度5％的CO2，含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)。 3.MTT法選擇TGF-β1和PDTC的適宜濃度將細胞懸液(細胞濃度為2×105個/ml)接種于96孔板中，培養(yǎng)24小時后，分別加入不同濃度的TGF-β1(1、10、20ng/ml)和PDTC(20、100、500uM)，培養(yǎng)24小時后測定

3、細胞MTT活力，根據MTT結果及參考文獻選擇TGF-β1和PDTC的適宜濃度。 4.CTGF和α-SMA的細胞免疫化學染色將細胞懸液接種于24孔板中，細胞濃度為2×105/ml，每孔加液1ml，進行細胞爬片。實驗分別分為以下幾組：sham組，TGF-β1組(濃度為10ng/ml)，PDTC+TGF-β1組(PDTC濃度為500uM，TGF-β1濃度為10ng/ml)，PDTC組(濃度為500uM)，各組藥物作用24小時。采用細胞

4、免疫化學染色技術，觀察CTGF和α-SMA陽性細胞。 5.流式細胞儀檢測肺成纖維細胞表達α-SMA 6.統(tǒng)計學分析數據均用均數±標準差((x)±SD)表示，采用SPSS-11.5統(tǒng)計軟件包，多個樣本均數比較用單因素方差分析(One-WayANOVA)，多個樣本均數間的兩兩比較用最小顯著差法(leastsignificantdifference，LSD)，P＜0.05作為判斷有顯著性差異的標準。 研究結果：

5、 1.MTT結果。濃度為1、10、20ng/ml的TGF-β1的MTT活力和濃度為20、100、500uM的PDTC的MTT活力與sham組比較沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，對肺纖維化模型大鼠肺成纖維細胞的活性均沒有影響。 2.肺成纖維細胞表達CTGF的免疫化學染色結果。TGF-β1誘導肺纖維化模型大鼠肺成纖維細胞表達CTGF，CTGF染色陽性細胞百分率(51.93±4.93％)和平均光密度值(0.413±0.016)與sha

6、m組(29.49±2.28％)(0.312±0.017)比較，明顯增加(P＜0.05)。PDTC+TGF-β1組的CTGF免疫染色陽性細胞百分率(30.36±2.66％)與TGF-β1組比較，明顯減少(P＜0.05)。單獨應用PDTC，不能抑制肺纖維化模型大鼠肺成纖維細胞表達CTGF，PDTC組CTGF免疫染色陽性細胞百分率(30.97±2.55％)與sham組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 3.肺成纖維細胞表達α-S

7、MA的免疫化學染色結果。TGF-β1誘導肺纖維化模型大鼠肺成纖維細胞表達α-SMA的陽性細胞百分率(44.71±2.57％)與sham組(31.6±2.10％)比較，明顯增加(P＜0.05)。PDTC明顯抑制了TGF-β1誘導的肺纖維化模型大鼠肺成纖維細胞表達α-SMA，PDTC+TGF-β1組的α-SMA免疫染色陽性細胞百分率(27.10±2.74％)與TGF-β1組比較，明顯減少(P＜0.05)。單獨應用PDTC，不能抑制成纖維細胞

8、表達α-SMA，PDTC組α-SMA免疫染色陽性細胞百分率(31.85±3.17％)與sham組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 4.流式細胞儀檢測成纖維細胞表達α-SMA的結果。TGF-β1組肺纖維化模型大鼠肺成纖維細胞表達α-SMA的X-Mode(42.45±2.75)與sham組(32.9±1.21)比較，明顯增加(P＜0.05)。PDTC+TGF-β1的X-Mode(26.35±7.28)和TGF-β1比較，明顯