2-甲氧基雌二醇對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞放療凋亡及乏氧誘導(dǎo)因子-1表達(dá)影響的研究.pdf

1、背景:瘢痕疙瘩是皮膚損傷愈合后形成的一種過度增生的異常瘢痕組織，表現(xiàn)為瘢痕組織過度增生，并向周圍正常組織浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。因其具有獨(dú)特的生長(zhǎng)特性及臨床表現(xiàn)，也被人們視為一種創(chuàng)傷愈合后形成的皮膚良性腫瘤。目前仍缺乏較為理想的治療方法。放療作為防止瘢痕疙瘩術(shù)后復(fù)發(fā)的治療手段，目前在臨床應(yīng)用較為廣泛。但由于瘢痕疙瘩自身具有放療抵抗，對(duì)放療不敏感，術(shù)后的復(fù)發(fā)率仍較高。乏氧被認(rèn)為是腫瘤放療不敏感的重要因素，而乏氧誘導(dǎo)因子-1則被認(rèn)為是乏氧調(diào)控的關(guān)鍵因子

2、。我們前期的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了瘢痕疙瘩組織中乏氧誘導(dǎo)因子高表達(dá)，且在接受放療后，其表達(dá)會(huì)進(jìn)一步升高。結(jié)合腫瘤研究領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)，我們推測(cè)瘢痕疙瘩組織中乏氧誘導(dǎo)因子-1與細(xì)胞放療的不敏感密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)擬要驗(yàn)證乏氧誘導(dǎo)因子-1是否是瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞放療抵抗的關(guān)鍵因子;通過乏氧誘導(dǎo)因子-1的抑制劑2ME2抑制乏氧誘導(dǎo)因子-1的表達(dá)，能否提高瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞放療的敏感性。
　　目的:
　　1.驗(yàn)證乏氧誘導(dǎo)因子-1在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的

3、高表達(dá)及放療后的變化。
　　2.探討乏氧誘導(dǎo)因子-1敲除后的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及其對(duì)放療敏感性的變化。
　　3.研究2ME2對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞放療凋亡的影響。
　　4.初步探討2ME2對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.在常氧和乏氧兩種狀態(tài)下培養(yǎng)細(xì)胞，通過Western Blot檢測(cè)放療前后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)差異。
　　2.通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖

4、維細(xì)胞，將HIF-1α基因敲除。通過CCK試劑檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)HIF-1α基因敲除后的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的放射凋亡情況。
　　3.通過用不同濃度的2ME2作用瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞24小時(shí)后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行放療。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的放射凋亡情況。CCK檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。
　　4.通過用不同濃度的2ME2作用瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞24小時(shí)后，通過qRT-PCR檢測(cè)HIF-1α基因表達(dá)，Western Blot檢測(cè)H

5、IF-1α蛋白表達(dá)，ELISA檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.在乏氧條件下，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)要高于常氧條件，且在接受放療后，HIF-1α蛋白表達(dá)量會(huì)進(jìn)一步升高。
　　2.HIF-1α基因敲除后的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞對(duì)放療更為敏感，細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組有明顯的增加，并集中于晚期凋亡，但細(xì)胞的生長(zhǎng)情況不受影響。
　　3.2ME2作用后的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞對(duì)放療更為敏感，細(xì)胞的放射

6、凋亡率較對(duì)照組有明顯的增高，并集中于晚期凋亡。且隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞的放射凋亡率不斷升高，呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)。
　　4.2ME2對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞HIF-1α基因表達(dá)沒有明顯影響，但卻能有效的抑制HIF-1α蛋白的表達(dá)。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)2ME2對(duì)HIF-1的結(jié)構(gòu)蛋白HIF-1β的表達(dá)也沒有影響。此外，2ME2還能抑制VEGF因子的分泌。最后，2ME2還可以明顯抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)。