RNAi沉默MACC1基因表達對乳腺癌MCF-7細胞增殖和遷移的實驗研究.pdf

1、目的:化學(xué)合成針對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasisassociated in colon cancer1，MACC1)的小干擾RNA(smallinterfering RNA，siRNA)，將其轉(zhuǎn)染人乳腺癌細胞株MCF-7，觀察MACC1表達受抑制后，結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(MACC1)對MCF-7細胞的增殖、遷移以及遷移相關(guān)蛋白S100A4和vimentin的影響。
　　方法:(1)將MACC1基因設(shè)計3個干擾序列和1個

2、陰性對照序列。(2)將3對MACC1-siRNA和1對陰性對照siRNA(negative controlsiRNA，NC-siRNA)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的MCF-7細胞，轉(zhuǎn)染48h后采用RT-PCR檢測MACC1mRNA的表達，將干擾效率最高的MACC1-siRNA用于后續(xù)實驗。(3)實驗分為3個組別:CON組（MCF-7空白對照組），NC組(MCF-7轉(zhuǎn)染陰性對照的siRNA)和siRNA組（MCF-7轉(zhuǎn)染目的siRNA）。(4)采用MT

3、T法觀察3組細胞的增殖狀態(tài)。(5)Transwell遷移實驗檢測3組細胞的遷移能力。(6) Western blot檢測遷移相關(guān)蛋白S100A4和vimentin的表達。
　　結(jié)果:(1) MACC1基因在乳腺癌MCF-7細胞高表達。(2)倒置熒光顯微鏡顯示各轉(zhuǎn)染組細胞發(fā)出綠色熒光，當(dāng)siRNA轉(zhuǎn)染試劑(ul):siRNA(ug)為5∶1時，MCF-7細胞轉(zhuǎn)染的效率最高，達85％以上。RT-PCR電泳結(jié)果顯示:MACC1-siRN

4、A1-3組MACC1 mRNA較正常對照組，表達水平分別下降了80.6％、31.8％、27.2％，提示MACC1-siRNA1的干擾效率最高。(3)針對MACC1基因的siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細胞48h后，siRNA組與空白對照組比，能夠顯著抑制MACC1蛋白合成，抑制效率為75％。(4)MACC1特異性siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細胞24、48、72h后，MTT結(jié)果顯示與空白對照組比較，siRNA組能夠抑制細胞生長，并隨著時間延長效果顯著

5、(P＜0.05)，將陰性對照組和空白對照組比，兩組的差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。(5)轉(zhuǎn)染MCF-7細胞48h后，Transwell遷移實驗結(jié)果顯示siRNA組與空白對照組比較，穿過小室細胞數(shù)明顯降低，其能有效抑制MCF-7細胞遷移(P＜0.05)，將空白對照組和陰性對照組比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。(6) siRNA組與空白對照組相比，遷移相關(guān)蛋白S100A4和vimentin表達降低(P＜0.05)，將空白對照組和陰