Pokemon對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲遷移能力的影響.pdf

1、目的：1.構(gòu)建表達(dá)pokemon基因的慢病毒載體，建立穩(wěn)定性表達(dá)pokemon基因的乳腺癌MCF-7細(xì)胞系，并分別觀察pokemon的高表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。2.探討乳腺癌組織中pokemon蛋白的表達(dá)及意義。
　　方法：實(shí)驗(yàn)分為兩部分：第一部分通過RT-PCT方法獲得pokemon-cDNA，將pokemon-cDNA與GV-165載體連接，得到帶有目的基因慢病毒表達(dá)載體，再將三種質(zhì)粒（GV165/Pokem

2、on、pHelper1.0、pHelper2.0）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝得到病毒載體原液并測(cè)定其滴度。將得到的高滴度pokemon表達(dá)病毒載體（pokemon組）和空白病毒載體（NC組）分別轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，建立穩(wěn)定高表達(dá)pokemon的乳腺癌MCF-7細(xì)胞系。通過熒光顯微鏡觀察Pokemon表達(dá)慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率，Western blot檢測(cè)GFP-Pokemon融合蛋白的表達(dá)能力，Transwell試驗(yàn)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pok

3、emon基因高表達(dá)對(duì) MCF-7細(xì)胞侵襲遷移能力的作用。第二部分利用免疫組織化學(xué)方法（IHC）檢測(cè)185例乳腺癌及23例邊緣組織組合芯片中pokemon基因的表達(dá)情況，并且分析pokemon的高表達(dá)和乳腺癌的發(fā)病年齡、腫瘤組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞核分級(jí)等臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：第一部分：1.成功構(gòu)建含有pokemon基因的慢病毒載體：1）通過RT-PCR方法獲得目的基因，將pokemon-cDNA和慢病毒載體表達(dá)

4、質(zhì)粒GV-165經(jīng)過酶切、連接、轉(zhuǎn)化后，得到GV165-pokemon重組載體，以上結(jié)果均經(jīng)過酶切及測(cè)序鑒定，與預(yù)期結(jié)果相符。2）將病毒載體三質(zhì)粒系統(tǒng)（Pokemon-GV165重組載體、pHelper1.0與 pHelper2.0）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48h后，離心后收集上清液，過濾器過濾后得到病毒濃縮液。3）將病毒稀釋后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24h后，通過RT-PCR測(cè)定所收集的病毒滴度為2.0×108 TU/mL。2.成功建立穩(wěn)定高表達(dá)p

5、okemon的MCF-7細(xì)胞系:1）在pokemon表達(dá)病毒載體和空白病毒載體(NC)轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞48小時(shí)后，在熒光顯微鏡下兩組細(xì)胞均可見GFP蛋白表達(dá)（綠色熒光）。2）pokemon轉(zhuǎn)染組GFP及融合蛋白的表達(dá)主要集中于細(xì)胞核，而空白病毒轉(zhuǎn)染組其表達(dá)主要分布于細(xì)胞質(zhì)。3）Western blot顯示在pokemon轉(zhuǎn)染組中6號(hào)克隆具有pokemon-GFP融合蛋白的表達(dá)，而空白病毒轉(zhuǎn)染組只有GFP蛋白表達(dá)。3.Transwell

6、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示pokemon組比NC組到達(dá)Transwell小室下室的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明pokemon可抑制MCF-7細(xì)胞的侵襲能力。4.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示pokemon組比NC組經(jīng)過8h、32h后細(xì)胞遷移的距離無(wú)明顯變化，表明pokemon基因?qū)CF-7細(xì)胞遷移能力無(wú)明顯影響。第二部分：1.pokemon蛋白在乳腺癌中的表達(dá)高于癌旁正常乳腺組織（P<0.05）。2.pokemon蛋白高表達(dá)和乳腺癌