靶向VEGF基因的siRNA和樹突狀細胞對乳腺癌MCF-7細胞作用的體外研究.pdf

1、目的：血管新生和免疫受抑是腫瘤發(fā)生的重要生物學(xué)機制。腫瘤患者體內(nèi)多存在免疫缺陷或功能受損，腫瘤細胞通過多種細胞和分子機制逃避機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，其中樹突狀細胞(DC)分化異常和對T細胞刺激能力的下降是導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的重要因素。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是主要的促血管新生因子，腫瘤細胞過量分泌的VEGF除了具有促血管新生活性外，還可通過抑制造血祖細胞來源的DC的分化而發(fā)揮免疫抑制作用?；赩EGF促血管新生活性和免疫抑制的雙重作用，

2、本研究擬應(yīng)用siRNA阻斷VEGF活性達到抗腫瘤血管新生的同時改善腫瘤免疫狀態(tài)，同時應(yīng)用體外誘導(dǎo)正常DC的聯(lián)合抗瘤作用，觀察這種聯(lián)合是否能夠增強體外抗瘤效果，為臨床抗腫瘤血管新生聯(lián)合DC免疫治療提供實驗依據(jù)。 方法：以MCF-7乳腺癌細胞為觀察對象，體外設(shè)計合成靶向VEGF的siRNA，采用siRNA技術(shù)靶向抑制MCF-7細胞VEGF基因的表達，觀察siRNA基因沉默效果及對靶細胞的影響；分離正常人外周血單個核細胞(PBMC)，在

3、一定細胞因子組合下誘導(dǎo)、培養(yǎng)DC;模擬腫瘤體內(nèi)環(huán)境，添加MCF-7乳腺癌細胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)DC，觀察MCF-7乳腺癌細胞培養(yǎng)上清對正常外周血單個核細胞誘導(dǎo)的DC分化、成熟及功能的影響，探討腫瘤機體內(nèi)DC的免疫抑制狀態(tài)；觀察VEGF下調(diào)后MCF-7乳腺癌細胞培養(yǎng)上清對正常外周血單個核細胞誘導(dǎo)的DC分化、成熟及功能的影響的變化，探討阻斷VEGF活性對于改善DC功能的作用；進一步探討靶向MCF-7細胞VEGF基因的siRNA和負載腫瘤抗原的DC

4、二者聯(lián)合對MCF-7細胞的抗瘤效果。 結(jié)果：設(shè)計合成的siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細胞后VEG.mRNA和蛋白表達水平明顯減低，同時抑制了靶細胞的增殖；在體外應(yīng)用粒-巨細胞集落刺激因子(GM-CSF)，白介素-4（IL-4）及腫瘤壞死因子α(TNF-α)能有效培養(yǎng)人外周血單個核細胞來源的DC.MCF-7乳腺癌細胞培養(yǎng)上清能夠明顯抑制正常外周血單個核細胞誘導(dǎo)的樹突狀細胞的分化成熟及抗原提呈能力，CD80、CD83、CD86和HLA-D

5、R的表達明顯降低(p<0.01)，DC致敏的CTL對MCF-7細胞殺傷活性及IL-12分泌和共刺激T淋巴細胞所分泌的IFN-γ明顯降低(p<0.01)；干擾VEGF基因后MCF-7乳腺癌細胞，培養(yǎng)上清對DCs的影響明顯降低，CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表達顯著升高，DC致敏的CTL對MCF-7細胞殺傷活性及IL-12分泌和共刺激T淋巴細胞所分泌的IFN-γ明顯升高(P<0.01)；靶向VEGF基因的siRNA和DC聯(lián)合應(yīng)

6、用可顯著抑制腫瘤細胞生長，細胞幾乎完全溶解，細胞殺傷率達99％。 結(jié)論：體外設(shè)計合成的雙鏈siRNA能有效抑制乳腺癌MCF-7細胞VEGF基因的表達，抑制腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤細胞的凋亡；MCF-7乳腺癌細胞上清明顯抑制外周血單個核細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的樹突狀細胞的分化、成熟及抗原提呈能力。下調(diào)VEGF后的MCF-7細胞上清對DCs的分化、成熟及功能的抑制作用明顯降低，從而推測VEGF在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和免疫抑制方面可能起著重要的作用