miR-187-和miR-451在大腸癌中的表達(dá)及細(xì)胞功能研究.pdf

1、目的:美國(guó)全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示:結(jié)直腸癌在女性常見(jiàn)癌癥中占第二位，在男性常見(jiàn)癌癥中占第三位。結(jié)直腸癌是多種因素、多個(gè)基因相互作用逐步發(fā)展的結(jié)果，其確切機(jī)制仍未完全闡明。微小RNA(microRNA)在細(xì)胞分化、細(xì)胞周期及凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。它通過(guò)擴(kuò)增、缺失、突變和后沉默等機(jī)制影響癌癥的發(fā)生發(fā)展。本課題組，早期利用基因芯片技術(shù)對(duì)miRNAs進(jìn)行篩查發(fā)現(xiàn)miR-187*及miR-451在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

2、（real-timequantitativereversetranscription-PCR，RT-PCR）的方法檢測(cè)miR-451結(jié)直腸癌組織標(biāo)本及結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平，并分析其臨床意義。進(jìn)一步應(yīng)用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT比色分析法以及流式細(xì)胞技術(shù)等方法檢測(cè)miR-187*對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期等過(guò)程的影響，闡明miR-187*在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的生物功能，為深入了解結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　 方法:<

3、br>　　 1收集2011年5月～2012年5月40例來(lái)自河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院、河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院結(jié)直腸癌手術(shù)標(biāo)本。每例標(biāo)本分別取自結(jié)直腸原發(fā)腫瘤組織及上（下）切緣正常黏膜且術(shù)后病理證實(shí)無(wú)癌組織侵犯的癌旁組織。新鮮標(biāo)本離體后迅速置于液氮中，于-80℃保存。40名患者術(shù)前未接受任何化療和放療。
　　 2選取8種結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2，DLD1，HCT116，HT29,LOVO,SW480，SW620，SW1116進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)

4、。
　　 3應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)8種結(jié)腸癌細(xì)胞株及結(jié)直腸正常黏膜組織中miR-187*和miR-451的表達(dá)水平，比較兩組間及SW620和SW480兩種細(xì)胞株間的表達(dá)水平是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)40例大腸癌組織及對(duì)應(yīng)大腸正常黏膜組織中miR-187*和miR-451的表達(dá)水平，比較兩組間表達(dá)差異，分析miR-187*和miR-451的表達(dá)與大腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系。
　　 5

5、對(duì)HCT116和SW1116兩種細(xì)胞進(jìn)行miR-187*轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)染miR-187*模擬物組作為實(shí)驗(yàn)組，將轉(zhuǎn)染無(wú)義寡核苷酸組作為對(duì)照組。
　　 6通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染后HCT116細(xì)胞和SW1116細(xì)胞集落形成情況，比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組間的差異。
　　 7HCT116細(xì)胞和SW1116細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染后12h、24h、36h、48h、60h，分別應(yīng)用MTT比色分析法檢測(cè)5個(gè)時(shí)段的OD值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察

6、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組間細(xì)胞增殖改變情況。
　　 8應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后HCT116細(xì)胞凋亡情況，比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組間的差異。
　　 9應(yīng)用spss13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）或均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間配對(duì)樣本采用Wilcoxon檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)，兩組間獨(dú)立樣本采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析，均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:

7、r>　　 1miR-187*和miR-451在結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2，DLD1，HCT116，HT29，LOVO，SW480，SW620，SW1116中的表達(dá)明顯低于在大腸正常黏膜表達(dá)量，并且在SW480、SW620兩種細(xì)胞株中的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞0.05。
　　 2miR-187*在40例患者癌組織中的表達(dá)量為0.165(0.106，0.428)，正常黏膜組織中的表達(dá)量為0.334(0.211，0.712)，大腸癌組織中

8、表達(dá)水平明顯低于正常黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.041）;miR-451在40例患者癌組織中的表達(dá)量為0.218(0.106，0.542)，正常黏膜組織中的表達(dá)量為0.633(0.274，1.468)，大腸癌組織中表達(dá)水平明顯低于正常黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 3miR-451的表達(dá)水平均與大腸癌患者的病理分型密切相關(guān)。miR-451在黏液癌中的表達(dá)水平為0.0899(0.0148，0.2948

9、)，明顯低于非黏液癌的0.4326(0.1695，0.8659)（P=0.044）;低分化癌中的表達(dá)水平為0.0574(0.0148，0.5194)，明顯低于中高分化癌的0.3271(0.1848，0.9158)(P=0.023)。miR-451表達(dá)與分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、年齡、性別無(wú)明顯關(guān)系，各指標(biāo)組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;miR-187*在黏液癌中的表達(dá)水平為0.110(0.070，0.390)，明顯低于非黏

10、液癌的0.840(0.355，1.628)，(P=0.001);年齡＜69歲的表達(dá)水平為1.270(0.435，1.955)，高于年齡＞69歲的0.390(0.150，1.070)(P=0.016)。miR-187*表達(dá)與分化程度、分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、性別無(wú)明顯關(guān)系，各指標(biāo)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4在HCT116細(xì)胞的平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞集落數(shù)（125±22）明顯低于對(duì)照組（4

11、13±78），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036);在SW1116細(xì)胞的平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞集落數(shù)（353±18）明顯低于對(duì)照組（667±28），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。
　　 5HCT116細(xì)胞和SW1116細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-187*后12h、24h、36h、48h、60h，通過(guò)MTT比色分析法檢測(cè)OD值，實(shí)驗(yàn)組在5個(gè)時(shí)段OD值均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.0001）。
　　 6HCT1

12、16細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組早期凋亡率（26.748±1.098）％高于對(duì)照組（23.010±1.279）％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024)，實(shí)驗(yàn)組晚期凋亡率（4.393±0.715）％與對(duì)照組(3.94±0.710)％差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1miR-187*和miR-451在大腸癌中低表達(dá)，提示二者可能對(duì)大腸癌具有抑癌作用。
　　 2miR-451在大腸黏液癌及低分化癌中表達(dá)水平下調(diào)

13、更明顯，提示其可能對(duì)判定大腸癌惡性程度和預(yù)后有一定的意義。
　　 3miR-187*在大腸黏液腺癌中表達(dá)水平下調(diào)更明顯，也提示其可能對(duì)判定大腸癌惡性程度和預(yù)后有一定的意義。
　　 4miR-187*在69歲之前發(fā)病的大腸癌組織表達(dá)量高于在69歲以后發(fā)病的結(jié)直腸癌組織表達(dá)量，提示時(shí)序性的miR-187*表達(dá)水平下調(diào)，可能與隨年齡增長(zhǎng)逐步增高的大腸癌發(fā)病率有關(guān)。
　　 5miR-187*可能通過(guò)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，