shRNA表達(dá)載體沉默Bcl-2基因、抑制B細(xì)胞淋巴瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：B細(xì)胞淋巴瘤與抗凋亡基因Bcl-2的過(guò)表達(dá)密切相關(guān)，調(diào)低該基因的表達(dá)將有助恢復(fù)細(xì)胞凋亡功能，逆轉(zhuǎn)腫瘤形成。RNA干擾(RNAi)能高效特異地調(diào)低基因表達(dá)，已廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的研究。本課題通過(guò)構(gòu)建Bcl-2shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B細(xì)胞淋巴瘤Raji細(xì)胞，體內(nèi)、外觀察shRNA表達(dá)載體對(duì)Raji細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá)的影響，以及對(duì)Raji細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，為進(jìn)一步研究B細(xì)胞淋巴瘤的基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：①軟件分析B

2、cl-2mRNA結(jié)構(gòu)以篩選出擬干擾靶位點(diǎn)，構(gòu)建Bcl-2shRNA重組質(zhì)粒pGenesil-1-Bcl-2-544和pGenesil-1-Bcl-2-1009，同時(shí)構(gòu)建陰性對(duì)照重組質(zhì)粒pGenesil-1-NC，經(jīng)測(cè)序和酶切鑒定后，提取各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞；②實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、pGenesil-1-Bcl-2-544組、pGenesil-1-Bcl-2-1009組和pGenesil-1-NC組進(jìn)行體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)。③在48h時(shí)測(cè)定細(xì)

3、胞凋亡和Bcl-2mRNA相對(duì)含量，以觀察各干擾重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞后對(duì)Bcl-2基因表達(dá)的抑制作用；④G418篩選獲得各重組質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞，RT-PCR、FCM、Western-blotting測(cè)定Bcl-2mRNA和蛋白的表達(dá)，細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定細(xì)胞增殖能力：⑤各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞接種BALB/c裸鼠，建立B細(xì)胞淋巴瘤荷瘤裸鼠模型；通過(guò)觀測(cè)成瘤時(shí)間、瘤體積和瘤重量，免疫組化測(cè)定Bcl-2蛋白表達(dá)，透射電鏡觀察瘤細(xì)胞

4、超微結(jié)構(gòu)，研究Bcl-2shRNA對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用。 結(jié)果：①測(cè)序和酶切鑒定證實(shí)重組質(zhì)粒pGenesil-1-Bcl-2-544、pGenesil-1-Bcl-2-1009和pGenesil-1-NC均成功構(gòu)建；②瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48h時(shí)，pGenesil-1-Bcl-2-544組和pGenesil-1-Bcl-2-1009組的凋亡指數(shù)分別是空白對(duì)照組的4.70和3.78倍(p<0.05)，對(duì)Raji細(xì)胞Bcl-2基因

5、表達(dá)的抑制率分別為31.91％和47.61％(與對(duì)照組相比，p<0.05)；③G418成功篩選出各重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Raji細(xì)胞，F(xiàn)CM測(cè)得各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞百分率均達(dá)97％以上；pGenesil-1-Bcl-2-544和pGenesil-1-Bcl-2-1009對(duì)Raji細(xì)胞Bcl-2mRNA的抑制率分別為72.71％和45.50％，與對(duì)照組相比差異具有顯著性意義(p<0.05)；FCM測(cè)得Bcl-2蛋白抑制率分別為73.37％和59.

6、67％(與對(duì)照組相比，p<0.05)，Western-blotting結(jié)果與FCM結(jié)果基本相符；對(duì)各組細(xì)胞增殖速度的比較表明，兩干擾組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖能力明顯下降；④pGenesil-1-Bcl-2-544組和pGenesil-1-Bcl-2-1009組移植瘤的平均成瘤時(shí)間明顯延遲，平均瘤體積、重量明顯下降，切片的免疫組化結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)兩干擾組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，透射電鏡顯示兩干擾組瘤細(xì)胞有一定比例的凋亡；⑤穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

7、明：pGenesil-1-Bcl-2-544組對(duì)Bcl-2基因的干擾作用較pGenesil-1-Bcl-2-1009組明顯，抑制瘤細(xì)胞的增殖也更明顯；而pGenesil-1-NC對(duì)Raji細(xì)胞Bcl-2基因無(wú)明顯干擾作用，對(duì)瘤細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。 結(jié)論：成功構(gòu)建Bcl-2shRNA重組質(zhì)粒pGenesil-1-Bcl-2-544和pGenesil-1-Bcl-2-1009；兩干擾重組質(zhì)粒能在體內(nèi)、外干擾Raji細(xì)胞Bcl-2基