稻瘟菌效應因子AvrPiz-t及其水稻靶蛋白APIP12的功能研究.pdf

1、植物在與病原微生物的自然競爭過程中，進化出兩個層次的免疫系統(tǒng)來識別和防御病原物。第一層是由植物跨膜受體類蛋白識別病原物模式分子觸發(fā)的免疫(PTI)。第二層是由植物抗病蛋白(R)識別病原茵的效應因子觸發(fā)的免疫(ETI)。本課題組在水稻Piz-t基因克隆的基礎上，圖位克隆了其對應的稻瘟菌無毒基因AvrPiz-t，并利用酵母雙雜交技術從水稻cDNA文庫篩選到12個AvrPiz-t互作蛋白(APIPs)，同時借助于核磁共振技術與合作實驗室解析了

2、AvrPiz-t的三維溶液結構。在此基礎上，本文開展了對稻瘟菌無毒基因AvrPiz-t和水稻互作蛋白APIP12的研究，主要結果如下:
　　1.利用已有的蛋白溶液結構信息，對AvrPiz-t預測的功能相關的氨基酸和表面分布的堿性氨基酸通過構建不同表達載體進行了突變，分別進行了功能互補，蛋白互作和亞細胞定位的研究。在AvrPiz-t突變體轉化稻瘟菌接種水稻的功能互補研究中，參與蛋白去泛素化的催化中心的H25A和N64A兩個關鍵氨基酸

3、突變都失去了無毒功能，而相鄰的Q22A的突變不影響其無毒功能，表明催化中心的氨基酸對AvrPiz-t的功能非常重要。與12個APIP蛋白的酵母雙雜互作研究中，C23A、H25A、A41V和C70A四個催化中心相關的氨基酸殘基突變體與APIP2、APIP6和APIP10泛素化功能相關的互作都明顯變弱或完全消失，進一步證明了AvrPiz-t的去泛素化活性中心氨基酸與泛素化蛋白的緊密聯(lián)系。同時，在互補分析中未失去無毒功能的Q22A和D89A突

4、變與12個APIP蛋白的互作也無明顯變化，表明AvrPiz-t的功能與APIP蛋白的互作存在著正相關性。在亞細胞定位的研究中，AvrPiz-t在細胞中的位置與葉綠體重合，而氨基酸的突變基本不影響其亞細胞定位的變化。
　　2.APIP12是AvrPiz-t在水稻中的互作蛋白，在N端和C端各有一個結構域與核孔蛋白Nup98同源，但不包含F(xiàn)G重復結構域，剩余序列在其它物種中找不到同源序列，因此APIP12可能是水稻的特有基因。我們通過酵

5、母雙雜和GSTPull-down驗證了AvrPiz-t與APIP12的相互作用。水稻接種稻瘟菌后APIP12的表達都明顯上調，表明APIP12參與了水稻稻瘟病的抗病反應。水稻中花11的APIP12基因敲除突變體和日本晴APIP12 RNAi轉基因系對稻瘟病的感病性增加，而且PR10等基因在敲除系中的表達下降。在Piz-t水稻中敲除或過表達APIP12不會影響其對含AvrPiz-t稻瘟菌的抗病性，而且APIP12與Piz-t的LRR，NT

6、和NBS結構域在酵母雙雜實驗中沒有檢測到互作，表明APIP12在Piz-t介導的抗病信號傳導途徑中并不重要。APIP12的位于細胞質中的未知結構內，但AvrPiz-t與APIP12共轉化煙草時，AvrPiz-t能夠與APIP12共定位，表明APIP12可能會與AvrPiz-t結合而改變其位置。APIP12與其它APIP蛋白中的APIP6和APIP8都能發(fā)生相互作用，因此這些APIP蛋白不是獨立存在的，APIP之間也存在相互作用。