細(xì)菌雙雜交篩選肽適體抑制稻瘟菌孢子.pdf

1、稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)是典型的植物致病菌，其侵染過程依賴多種信號(hào)通路參與調(diào)控，包括環(huán)化腺苷酸(cAMP)信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路和Ca2+信號(hào)通路。最新研究發(fā)現(xiàn)，除了cAMP信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路，Ca2+信號(hào)通路在稻瘟菌的生長(zhǎng)發(fā)育、孢子萌發(fā)、侵染結(jié)構(gòu)形成和致病性方面也具有重要作用。
　　鈣調(diào)蛋白(calmodul

2、in，CaM)，是Ca2+信號(hào)通路中的重要組成部分，在稻瘟菌各個(gè)發(fā)育階段分布廣泛，并且與稻瘟菌孢子萌發(fā)和附著胞形成密切相關(guān)，是研究稻瘟菌Ca2+信號(hào)通路的關(guān)鍵性切入點(diǎn)。
　　鈣調(diào)蛋白拮抗劑是以鈣調(diào)蛋白為靶點(diǎn)的藥物，對(duì)研究鈣調(diào)蛋白在稻瘟菌致病性方面的功能具有重要意義。但是，目前市場(chǎng)上鈣調(diào)蛋白拮抗劑均具有專一性不強(qiáng)的特點(diǎn)，且無任何稻瘟菌鈣調(diào)蛋白拮抗劑的研究報(bào)道，使得鈣調(diào)蛋白拮抗劑不僅單一作用于稻瘟菌鈣調(diào)蛋白，還會(huì)影響其他的通路蛋白，無

3、法實(shí)現(xiàn)單一變量的實(shí)驗(yàn)策略。
　　本研究采用細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)，以稻瘟菌鈣調(diào)蛋白CaM為“誘餌”，從肽適體文庫(kù)中篩選得到既能與CaM特異性相互作用，又具有抑制稻瘟菌孢子發(fā)育功能的肽適體（peptide aptamer，pep-aptamer），并對(duì)肽適體與CaM之間相互作用的分子機(jī)理進(jìn)行了的初步探究，所獲結(jié)果如下：
　　克隆稻瘟菌鈣調(diào)蛋白CaM，構(gòu)建“誘餌”表達(dá)載體pBT-CaM，利用細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)，從肽適體文庫(kù)中篩選獲得了34條

4、能夠與CaM特異性相互作用的肽適體。
　　誘導(dǎo)表達(dá)34條肽適體蛋白并分別與稻瘟菌孢子懸液孵育，篩選出7種具有抑制稻瘟菌孢子發(fā)育的肽適體。通過核苷酸序列分析和氨基酸序列分析，最終確定肽適體D4為篩選得到的序列正確、且具有特異性抑制孢子能力的肽適體。
　　分別構(gòu)建表達(dá)肽適體D4及CaM的載體pET-SNP-D4和pET-28a-CaM，經(jīng)轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)、鎳柱親和層析和透析后，抑菌實(shí)驗(yàn)證實(shí)肽適體SNP-D4對(duì)稻瘟菌孢子的萌發(fā)、芽管

5、的生長(zhǎng)以及附著胞的形成均具有良好的抑制效果。
　　通過酶連免疫吸附技術(shù)（ELISA）推算出CaM與SNP-D4之間的親和作用常數(shù)Kd值達(dá)到20μM。構(gòu)建稻瘟菌CaM蛋白ΔC73和ΔN76截短體，細(xì)菌雙雜交證明肽適體SNP-D4作用于CaM蛋白的N端。
　　綜上所述，本研究首次采用細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)，以稻瘟菌CaM蛋白為靶標(biāo)篩選出了既能與CaM特異性相互作用、又具有抑制稻瘟菌孢子發(fā)育功能的肽適體SNP-D4，并對(duì)SNP-D4與Ca