稻瘟菌蛋白激發(fā)子MoHrip2結(jié)構(gòu)與功能及互作蛋白研究.pdf

1、在長(zhǎng)期的進(jìn)化中，植物形成了一套有效的免疫系統(tǒng)應(yīng)對(duì)逆境環(huán)境。植物免疫是基于對(duì)環(huán)境中誘導(dǎo)子的識(shí)別，蛋白質(zhì)激發(fā)子是最主要的誘導(dǎo)子之一，已成為植物免疫領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)激發(fā)子MoHrip2是從稻瘟菌中分離獲得的一種外分泌蛋白，能夠誘導(dǎo)煙草免疫系統(tǒng)的激活，提高水稻對(duì)白葉枯病和稻瘟病的抗性。然而，MoHrip2作為激發(fā)子的作用機(jī)理尚不清楚。本研究從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、互作蛋白的篩選與驗(yàn)證以及生物學(xué)功能等方面對(duì)MoHrip2進(jìn)行研究

2、，獲得了以下研究成果：
　　1、解析獲得MoHrip2的三維結(jié)構(gòu)
　　通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了MoHrip2蛋白以及摻入硒原子的蛋白衍生物，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶條件進(jìn)行篩選并優(yōu)化，最終獲得MoHrip2蛋白母體及衍生物的高質(zhì)量單晶；利用X-射線衍射技術(shù)獲得了MoHrip2蛋白母體及衍生物的衍射數(shù)據(jù)，分辨率分別可達(dá)2?和1.8?；通過(guò)硒原子產(chǎn)生的反常散射數(shù)據(jù)，確定了MoHrip2蛋白晶體的相位，每個(gè)不對(duì)稱單元含有兩個(gè)單體；利用COOT軟

3、件進(jìn)行模型搭建和精細(xì)修改，解析獲得了MoHrip2的三維結(jié)構(gòu)，每個(gè)單體形成一個(gè)β-桶狀結(jié)構(gòu)，包括11個(gè)β-折疊片和一個(gè)很短的α-螺旋，分子內(nèi)形成3對(duì)二硫鍵；通過(guò)DALI軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)MoHrip2與TL-XI蛋白在結(jié)構(gòu)上具有很高的相似度。
　　2、確定了MoHrip2的功能域
　　基于二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)MoHrip2蛋白進(jìn)行截短并利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和純化，獲得了8個(gè)截短突變體；對(duì)各截短突變體進(jìn)行誘導(dǎo)煙草HR和抗病性分析，

4、確定位于中間部位的第76-89位共14個(gè)氨基酸殘基組成的短肽段，是MoHrip2發(fā)揮激發(fā)子活性的功能域。
　　3、獲得MoHrip2在擬南芥中的互作蛋白Mo2BP1
　　以MoHrip2為誘餌蛋白，通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)篩選擬南芥cDNA文庫(kù)，獲得了4個(gè)候選互作蛋白；通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，其中一個(gè)蛋白能夠在煙草細(xì)胞中與MoHrip2互作，命名為Mo2BP1；Mo2BP1為一個(gè)類奇異果甜-病程相關(guān)蛋白，在植物體內(nèi)參與

5、響應(yīng)外源刺激；對(duì)Mo2BP1進(jìn)行適應(yīng)大腸桿菌表達(dá)的密碼子優(yōu)化，并重組表達(dá)、純化獲得GST-Mo2BP1融合蛋白；通過(guò)GST pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兩個(gè)蛋白在體外能夠相互作用。
　　4、Mo2BP1缺失影響MoHrip2的功能
　　在煙草葉片細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)Mo2BP1-GFP融合蛋白，使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察熒光，確定Mo2BP1在煙草細(xì)胞中定位于細(xì)胞膜上；購(gòu)買獲得Mo2BP1缺失突變雜合擬南芥，通過(guò)培育、篩選獲得其純