糖苷酶抑制劑的戈謝病分子伴侶機制和HDAC抑制劑的抗腫瘤機制研究.pdf

1、酶蛋白幾乎參與機體所有的生命活動，其功能對于機體的正常運行至關(guān)重要，許多疾病的發(fā)生都與酶功能的失調(diào)有關(guān)。因此，以酶為靶點的藥物開發(fā)一直都是研究的熱點。其中，酶抑制劑類藥物占據(jù)臨床用藥的三分之一，成為新藥來源的主要途徑。
　　糖苷酶是一類將寡糖等糖基復(fù)合物的糖苷鍵水解的酶，主要參與食物的消化、多糖和糖脂復(fù)合物的降解。糖苷酶抑制劑可以抑制糖苷酶的活性，阻斷碳水化合物的分解，對一些糖代謝紊亂疾病如溶酶體貯積癥、糖尿病等有重要藥用價值。同

2、時，以糖苷酶抑制劑為工具，可以更好的了解糖苷酶的水解機制，分析糖基化的生物學(xué)作用，利于揭示阿爾茨海默病、腫瘤等重大疾病的發(fā)生機制。因此，圍繞酶抑制劑藥物的開發(fā)，本課題開展了糖苷酶抑制劑和組蛋白去乙?；敢种苿┑脑O(shè)計、篩選和機制分析，為相關(guān)疾病靶向藥物的開發(fā)提供了依據(jù)和新思路。
　　戈謝病是一種由于酸性β-葡萄糖腦苷酶(acidβ-glucocerebrosidase，GCase)基因突變引起的發(fā)病率最高的溶酶體貯積病。該酶基因的突

3、變將導(dǎo)致GCase的提前降解，最終不能定位于溶酶體中發(fā)揮活性，從而使底物葡萄糖腦苷脂(Glucosylcera-mide，GC)大量積累?；诿傅母偁幮砸种苿C制，人體提出了分子伴侶設(shè)想:競爭性抑制劑與突變酶的活性中心結(jié)合，誘導(dǎo)酶形成正確折疊，并輔助酶定位于溶酶體，在高濃度底物的溶酶體中，競爭性抑制劑被底物競爭性解離，酶分子得以釋放，從而發(fā)揮生物功能。依據(jù)該酶的催化機制，本課題組前期設(shè)計、合成系列葡萄糖咪唑類化合物，本課題中通過生物學(xué)活

4、性測試，發(fā)現(xiàn)化合物具有強抑制活性和高選擇性，且細(xì)胞膜透過性好，細(xì)胞毒性低。以發(fā)病率最高的兩種成淋巴細(xì)胞(N370S，L444P)為模型，我們發(fā)現(xiàn)該類化合物均具有較好的伴侶活性，尤其是化合物11（3，3-二甲基-N-苯基-4-酰胺-1-丁基取代的葡萄糖咪唑），2.5μM的用藥濃度下，可使N370S型GCase酶活提高2.1倍。利用計算機模擬、脈沖酶解穩(wěn)定性試驗、Westernblot和細(xì)胞免疫熒光試驗等方法分析，發(fā)現(xiàn)化合物11可以結(jié)合并穩(wěn)

5、定突變GCase酶的結(jié)構(gòu)，提高其蛋白水平，促進其溶酶體定位，最終提高細(xì)胞中GCase的活性。
　　N-乙酰葡萄糖胺（O-linkedN-acetylglucosamine，O-GlcNAc）修飾是一種重要的蛋白翻譯后修飾，參與生物體中的多種細(xì)胞活動，O-GlcNAcase(OGA)是體內(nèi)唯一水解該修飾的糖苷酶。有人發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病人的大腦中Tau蛋白的O-GlcNAc修飾嚴(yán)重不足，因此，我們設(shè)想通過OGA抑制劑來提高患者體內(nèi)的O-

6、GlcNAc修飾水平。利用前期設(shè)計、合成的系列化合物，通過酶學(xué)篩選，獲得了一個高效選擇性的OGA抑制劑（Ki=5.9μM），與陽性化合物PUGNAc相比它能更多地提高細(xì)胞內(nèi)的O-GlcNAc水平。同時，利用體外分段表達，我們獲得了一個OGA變體(細(xì)胞凋亡過程中的OGA剪切體，nOGA)的專一性抑制劑。所篩選的這些OGA抑制劑將有助于進一步揭示細(xì)胞內(nèi)O-GlcNAc修飾的機制，闡明與O-GlcNAc修飾相關(guān)疾病的病因，為相關(guān)藥物的研發(fā)提供

7、了基礎(chǔ)。
　　組蛋白去乙?；?Histonedeacetylases，HDACs)是一類調(diào)控染色體形成和基因表達的關(guān)鍵酶。當(dāng)組蛋白處于低乙?；癄顟B(tài)時，核小體結(jié)構(gòu)緊密，使各種促進細(xì)胞分化和凋亡的基因受到抑制，引起腫瘤的發(fā)生。HDACs抑制劑(HDACi)通過抑制HDAC去乙?；钚?，阻滯腫瘤細(xì)胞生長，誘導(dǎo)其分化和凋亡。因此，以HDACs為靶點，設(shè)計合成抗腫瘤藥物具有廣闊的前景。依據(jù)前期設(shè)計、合成的系列HDACi，通過體外酶活和細(xì)胞

8、毒性篩選，我們獲得了化合物Z-13，它對HDAC酶活性和腫瘤細(xì)胞增殖的抑制都要比陽性藥SAHA（suberoylanilidehydroxamicacid）高一個數(shù)量級。通過對它抗腫瘤機制的研究，發(fā)現(xiàn)它主要通過阻遏細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，來抑制腫瘤細(xì)胞增殖，延緩體內(nèi)乳腺癌腫瘤的生長。同時，我們做了SAHA和taxol聯(lián)合用藥對乳腺癌細(xì)胞抑制的影響，發(fā)現(xiàn)，SAHA能增強taxol對乳腺癌細(xì)胞的抑制，尤其是增強了taxol對其不敏感的乳腺癌