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文檔簡介
1、第一部分:幽門螺桿菌NapA-CtxB融合蛋白的基因克隆與表達目的:采用基因工程技術(shù)克隆、表達幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)中性粒細胞激活蛋白NapA與霍亂毒素B亞單位ctxB融合基因NapA-ctxB,為研制H.pylori疫苗提供有效抗原,為探討NapA致病機理、制備預防H.pylori感染的疫苗奠定基礎。 方法:用PCR方法擴增ctxg目的基因片段,克隆至pQE30-NapA質(zhì)粒的Na
2、pA基因上游,構(gòu)建含雙基因的表達質(zhì)粒pQE-nctB,轉(zhuǎn)化E.coliDH5a,經(jīng)IPTG誘導表達融合蛋白NCTB;Westernblot分析其抗原性。 結(jié)果:經(jīng)測序HCTB融合基因片段由807bp組成,編碼269個氨基酸殘基的多肽。經(jīng)SDS-PAGE分析相對分子量(Mr)約為30000。可溶性表達占全菌的27%以上,經(jīng)親和層析后可獲得純度為94%以上的重組蛋白。Westernblot分析顯示能分別與NpaA抗血清和CT抗血清反
3、應。 結(jié)論:NapA和ctxB融合基因原核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功,并在大腸桿菌DH5a中高效的表達。 第二部分:幽門螺桿菌重組NapA-IgY和NapA-CtxB-IgY的制備 目的:以重組幽門螺桿菌中性粒細胞激活蛋白(NapA)和NapA-CtxB為抗原,制備高效價的抗NapA蛋黃抗體(IgY)和抗NCTB蛋黃抗體(IgY),為研制幽門螺桿菌治療、預防性抗體奠定基礎。 方法:以制備的重組蛋白免疫雞,水稀釋結(jié)合
4、氯仿有機沉淀法提取IgY。ELISA法測定抗體產(chǎn)生的時間一效價變化。將效價高的NapA—IgY和NCTB-IgY分別混合,硫酸銨沉淀法純化濃縮,間接ELISA法測定效價,Bradford法測定蛋白含量。Westemblot檢測制備的NapA-IgY和NapA-CtxB-IgY的抗體活性。 結(jié)果:Nap重組蛋白和NCTB融合蛋白免疫雞后的蛋黃提取物可與該蛋白發(fā)生免疫反應,IgY效價隨免疫時間增加而升高。經(jīng)純化濃縮后,NapA-Ig
5、Y的效價為l:12800,蛋白濃度為23.67mg/ml;NapA-CtxB-IgY的效價為1:25600蛋白濃度為30.02mg/ml。 結(jié)論:成功制備了高濃度、高效價的NapA-IgY和NapA-CtxB-IgY。 第三部分:重組NapA卵黃抗體抗幽門螺桿菌感染的體外研究 目的:探討重組NapA的雞蛋黃抗體(NapA-IgY)抑制H.pylori對胃癌細胞系AGS細胞的黏附作用,評價其抗H.pylori感染的
6、可行性,為制備抗H.pylori感染的預防性制劑奠定基礎。 方法:設定實驗組和對照組,然后把胃癌細胞株AGS細胞以1×106/ml的密度接種于細胞培養(yǎng)瓶中,48h后,當細胞處于指數(shù)生長期時,實驗組中先加入1ml濃度為0.5mg/ml的NapA-IgY,半小時后加入lml濃度1×108CFU/ml的H.pylori菌液,繼續(xù)孵育4小時后,采用掃描電鏡(SEM)觀察H.pylori對AGS細胞的粘附情況。對照組的AGS細胞不加入Na
7、pA—IgY,半小時后直接加入lml細菌1×108CFU/ml的H.pylori菌液??瞻捉M的AGS細胞既不加H.pylori菌液,也不加NapA—IgY。結(jié)果:4個小時后,掃描電鏡(SEM)下可見空白組AGS細胞周圍基本沒有H.pylori粘附,實驗組AGS細胞周圍粘附H.pylori較少,對照組AGS細胞周圍粘附有大量的H.pylori。 結(jié)論:重組Nap的雞蛋黃抗體(NapA-IgY)能抑制H.pylori對胃癌細胞系AG
8、S細胞的黏附,有阻止H.pylori定植的作用??捎糜谥苽漕A防H.pylori感染的制劑。 第四部分:重組NapA卵黃抗體抗幽門螺桿菌感染的體內(nèi)研究 目的:通過小鼠口服NapA-IgY進行預防H.pylori的感染,評價其抗H.pylori感染的可行性,為制備抗H.pylori感染的預防性IgY制劑奠定基礎。 方法:按照口服NapA-IgY制劑量的大小將BALB/~小鼠隨機分成四組(1mg/ml;100ug/ml
9、;60ug/ml;30ug/m1),同時設立陽性對照組(幽門螺桿菌感染組)和陰性對照組(腦心浸液灌胃)。將NapA-IgY以間隔2天,分三次的方法口服灌胃BALB/c小鼠,2、4、6周后分批處死BALB/c小鼠,然后進行細菌的定量培養(yǎng),快速尿素酶實驗,常規(guī)HE染色后對胃炎進行分級。 結(jié)果:H.pylori感染組的總感染率為70%,當NapA-IgY抗體制劑量為30ug/ml時就可以達到效理想的預防作用。 結(jié)論:成功建立幽
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