抗幽門螺桿菌VacA和HpaA雙特異性單克隆抗體的制備.pdf

1、研究目的：通過細(xì)胞雜交-雜交瘤技術(shù)制備抗幽門螺桿菌細(xì)胞空泡毒素（VacA）和粘附素（HpaA）抗原的雙特異性單克隆抗體，并初步鑒定其生物學(xué)、免疫學(xué)和理化特性。為幽門螺桿菌（H.pylori）感染的防治研究、診斷試劑盒的研制及探討其致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法：自重組幽門螺桿菌細(xì)胞空泡毒素、粘附素（pQE30-V/H-DH5α）基因工程菌提取細(xì)胞空泡毒素（VacA）和粘附素（HpaA）的重組蛋白，12％SDS-PAGE電泳鑒定，以Va

2、cA-HpaA重組蛋白為免疫原，免疫BALB/c小鼠。取免疫BALB/c小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0，用50％聚乙二醇（PEG）融合，HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)出雜交瘤細(xì)胞。以純化的rVacA為抗原，間接ELISA法初篩分泌抗VacA抗體的雜交瘤細(xì)胞，有限稀釋法克隆化培養(yǎng)獲得穩(wěn)定分泌抗rVacA單抗的陽性雜交瘤細(xì)胞株。陽性雜交瘤細(xì)胞株再與血清HpaA高滴度的免疫BALB/c小鼠脾細(xì)胞用50％聚乙二醇（PEG）融合，HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)出

3、雜交瘤細(xì)胞，分別用純化的rVacA、rHpaA為抗原，間接ELISA法篩選同時(shí)分泌抗VacA和HpaA抗體的雜交-雜交瘤細(xì)胞，有限稀釋法克隆化培養(yǎng)獲得穩(wěn)定分泌抗rVacA和rHpaA雙特異性單克隆抗體陽性的雜交-雜交瘤細(xì)胞株。陽性細(xì)胞株體外連續(xù)傳30代、反復(fù)凍存復(fù)蘇6次、液氮中凍存1.5個(gè)月后復(fù)蘇，測(cè)定細(xì)胞株分泌的雙特異性單克隆抗體的穩(wěn)定性。做雜交-雜交瘤細(xì)胞的染色體計(jì)數(shù)并與骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0和小鼠骨髓細(xì)胞的染色體計(jì)數(shù)進(jìn)行比較。制備

4、腹水型和上清型雙特異性單克隆抗體，以飽和硫酸銨沉淀法和免疫親和層析法進(jìn)行純化，Bradford法測(cè)定其蛋白濃度，Western blot檢測(cè)其免疫特異性，b.v公司的抗體亞型檢測(cè)試劑盒測(cè)定雙特異性單克隆抗體的Ig類別，ELISA間接法測(cè)定其抗體效價(jià)及親和常數(shù)。測(cè)定pH值對(duì)雙特異性單克隆抗體穩(wěn)定性影響實(shí)驗(yàn)，分別以0.05M pH2.2甘氨酸-鹽酸緩沖液、0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液和0.01MpH7.4磷酸鹽緩沖液將腹水型雙特異性單

5、克隆抗體（以免疫前小鼠血清作陰性對(duì)照）作1：10稀釋，4℃靜置24h、48h后，用間接ELISA測(cè)定其0D450nm與陰性對(duì)照0D450nm的比值。 結(jié)果：自基因工程菌pQE30-V/H-DH5α中提取重組VacA-HpaA融合蛋白，12％SDS-PAGE鑒定后，作為免疫原成功免疫小鼠。經(jīng)兩次細(xì)胞融合，HAT選擇培養(yǎng)，抗體檢測(cè)篩選，獲得37孔分泌同時(shí)抗rVacA和rHpaA雙特異性單克隆抗體的融合細(xì)胞孔，經(jīng)克隆化培養(yǎng)得到3株穩(wěn)定

6、分泌雙特異性單克隆抗體的雜交.雜交瘤細(xì)胞株，命名為fB8、fC5和fE7，其分泌的雙特異性單克隆抗體均可與純化的rVacA或rHpaA蛋白特異性結(jié)合。fB8雜交-雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定性較好，體外連續(xù)傳30代、反復(fù)凍存復(fù)蘇6次、液氮中凍存1.5個(gè)月后復(fù)蘇測(cè)定細(xì)胞株仍可穩(wěn)定分泌雙特異性單克隆抗體。fB8雜交-雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)為127±5條，而小鼠脾細(xì)胞為40條，Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞為64±3條。三株同時(shí)坑rVacA和rHpaA的雙特異性單克

7、隆抗體雜交-雜交次瘤細(xì)胞（fB8、fC5和fE7）分泌的抗體均為IgG1。fB8腹水型雙特異性單克隆抗體的效價(jià)為5.12×105，蛋白濃度為11.32 mg/ml（Bradford法）。pH值對(duì)雙特異性單克隆抗體穩(wěn)定性影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酸性和堿性都可使雙特異性單克隆抗體穩(wěn)定性下降。 結(jié)論：初步建立起三株分泌同時(shí)抗幽門螺桿菌細(xì)胞空泡毒素和粘附素雙特異性單克隆抗體的雜交-雜交瘤細(xì)胞株.成功制備并純化了抗VacA和HpaA的雙特異性