JWA在苯并（a）芘和過氧化氫所致HeLa細(xì)胞DNA氧化損傷過程中的作用研究.pdf

1、本課題運(yùn)用分子生物學(xué)手段構(gòu)建JWA基因反義RNA重組載體并轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，建立JWA蛋白缺陷細(xì)胞株，以研究JWA基因表達(dá)缺陷對(duì)B(a)P和H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷與修復(fù)過程所造成的影響及可能機(jī)制。 第一部分JWA基因反義RNA綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建用RT-PCR方法從人支氣管上皮細(xì)胞(HBE)中擴(kuò)增出JWA基因cDNA編碼區(qū)一段長(zhǎng)339bp的目標(biāo)片斷，經(jīng)由pGEM-Teasy載體獲得克隆并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后再反向插入綠色熒

2、光蛋白表達(dá)載體pEGFP-C1中，篩選、克隆、抽提質(zhì)粒，從而構(gòu)建JWA基因反義RNA真核表達(dá)載體pEGFP-C1-asJWA。 第二部分JWA蛋白表達(dá)缺陷細(xì)胞株的建立、鑒定及生物學(xué)特性觀察用構(gòu)建的JWA基因反義RNA綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體(pEGFP-C1-asJWA)轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞，用蛋白免疫印跡法鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中JWA基因的表達(dá)水平，同時(shí)觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞(asJWA-HeLa)形態(tài)和生長(zhǎng)速度，繪制生長(zhǎng)曲線，分析細(xì)胞周期

3、。 第三部分JWA參與調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)答氧化應(yīng)激的作用研究首先建立了不同濃度H2O2和B(a）P致Cl-HeLa和asJWA-HeLa細(xì)胞DNA氧化損傷模型。當(dāng)H2O2以不同濃度(終濃度0、0.01、0.10和1.00mM)處理C1-HeLa和asJWA-HeLa細(xì)胞30min時(shí)，彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DNA損傷程度與H2O2濃度間呈現(xiàn)出明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，且asJWA-HeLa細(xì)胞DNA損傷重于C1-HeLa細(xì)胞。Westernblott

4、ing檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在此過程中，JWA和Hsp70的表達(dá)水平增加亦呈現(xiàn)出明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系；在JWA基因表達(dá)缺陷細(xì)胞，Hsp70表達(dá)呈代償性增高。在B(a)P氧化損傷模型中亦發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，即JWA和Hsp70的表達(dá)水平亦呈現(xiàn)出明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，且當(dāng)JWA基因表達(dá)缺陷時(shí)，Hsp70表達(dá)同樣是代償性增高的。綜上，細(xì)胞應(yīng)答氧化應(yīng)激時(shí)，JWA似乎表現(xiàn)出與Hsp70相關(guān)且平行的細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)功能，均起著保護(hù)細(xì)胞、抗氧化損傷的作用。 其次，建立

5、asJWA-HeLa細(xì)胞DNA損傷后修復(fù)動(dòng)力學(xué)觀察模型，在S9活化狀態(tài)下以50μMB(a)P處理細(xì)胞3h，再恢復(fù)不同時(shí)間，用堿性單細(xì)胞凝膠電泳鑒定DNA損傷和修復(fù)情況。在B(a)P致DNA損傷模型中，asJWA-HeLa細(xì)胞的DNA損傷程度重于對(duì)照細(xì)胞，并且出現(xiàn)明顯的DNA修復(fù)延遲現(xiàn)象。提示JWA不僅參與細(xì)胞DNA氧化損傷過程的調(diào)節(jié)，同時(shí)也參與DNA修復(fù)過程。 最后，為進(jìn)一步研究JWA是否可以直接影響HeLa細(xì)胞胞漿內(nèi)活性氧的生