JWA在苯并（a）芘和過氧化氫所致HeLa細胞DNA氧化損傷過程中的作用研究.pdf

1、本課題運用分子生物學手段構(gòu)建JWA基因反義RNA重組載體并轉(zhuǎn)染HeLa細胞，建立JWA蛋白缺陷細胞株，以研究JWA基因表達缺陷對B(a)P和H2O2誘導細胞DNA損傷與修復過程所造成的影響及可能機制。 第一部分JWA基因反義RNA綠色熒光蛋白真核表達載體的構(gòu)建用RT-PCR方法從人支氣管上皮細胞(HBE)中擴增出JWA基因cDNA編碼區(qū)一段長339bp的目標片斷，經(jīng)由pGEM-Teasy載體獲得克隆并經(jīng)測序驗證后再反向插入綠色熒

2、光蛋白表達載體pEGFP-C1中，篩選、克隆、抽提質(zhì)粒，從而構(gòu)建JWA基因反義RNA真核表達載體pEGFP-C1-asJWA。 第二部分JWA蛋白表達缺陷細胞株的建立、鑒定及生物學特性觀察用構(gòu)建的JWA基因反義RNA綠色熒光蛋白真核表達載體(pEGFP-C1-asJWA)轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細胞，用蛋白免疫印跡法鑒定轉(zhuǎn)染細胞中JWA基因的表達水平，同時觀察轉(zhuǎn)染細胞(asJWA-HeLa)形態(tài)和生長速度，繪制生長曲線，分析細胞周期

3、。 第三部分JWA參與調(diào)節(jié)細胞應(yīng)答氧化應(yīng)激的作用研究首先建立了不同濃度H2O2和B(a）P致Cl-HeLa和asJWA-HeLa細胞DNA氧化損傷模型。當H2O2以不同濃度(終濃度0、0.01、0.10和1.00mM)處理C1-HeLa和asJWA-HeLa細胞30min時，彗星實驗檢測發(fā)現(xiàn)DNA損傷程度與H2O2濃度間呈現(xiàn)出明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，且asJWA-HeLa細胞DNA損傷重于C1-HeLa細胞。Westernblott

4、ing檢測發(fā)現(xiàn)，在此過程中，JWA和Hsp70的表達水平增加亦呈現(xiàn)出明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系；在JWA基因表達缺陷細胞，Hsp70表達呈代償性增高。在B(a)P氧化損傷模型中亦發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，即JWA和Hsp70的表達水平亦呈現(xiàn)出明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，且當JWA基因表達缺陷時，Hsp70表達同樣是代償性增高的。綜上，細胞應(yīng)答氧化應(yīng)激時，JWA似乎表現(xiàn)出與Hsp70相關(guān)且平行的細胞內(nèi)生物學功能，均起著保護細胞、抗氧化損傷的作用。 其次，建立

5、asJWA-HeLa細胞DNA損傷后修復動力學觀察模型，在S9活化狀態(tài)下以50μMB(a)P處理細胞3h，再恢復不同時間，用堿性單細胞凝膠電泳鑒定DNA損傷和修復情況。在B(a)P致DNA損傷模型中，asJWA-HeLa細胞的DNA損傷程度重于對照細胞，并且出現(xiàn)明顯的DNA修復延遲現(xiàn)象。提示JWA不僅參與細胞DNA氧化損傷過程的調(diào)節(jié)，同時也參與DNA修復過程。 最后，為進一步研究JWA是否可以直接影響HeLa細胞胞漿內(nèi)活性氧的生