茶樹(shù)中過(guò)氧化氫酶的初步研究.pdf

1、過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)能夠清除植物體內(nèi)過(guò)多的過(guò)氧化氫，從而減少其對(duì)細(xì)胞的過(guò)氧化傷害，是植物中極為重要的逆境生理酶。本文對(duì)茶樹(shù)中CAT活力測(cè)定的pH、反應(yīng)時(shí)間等條件進(jìn)行了優(yōu)化;研究了不同季節(jié)、不同品種等條件下茶樹(shù)CAT活力的變化規(guī)律;獲得了茶樹(shù)鮮葉中過(guò)氧化氫酶的分離純化方法，并初步探究了其最適溫度、pH等酶學(xué)性質(zhì)。
　　波長(zhǎng)為240nm的紫外分光光度法和波長(zhǎng)為405nm的鉬酸銨比色法用于測(cè)定茶樹(shù)中過(guò)氧化氫酶活力是可行

2、的。在以緩沖液、底物和粗酶液組成的反應(yīng)體系中，過(guò)氧化氫含量在240nm波長(zhǎng)下、鉬酸銨與過(guò)氧化氫的絡(luò)合物的含量在405nm波長(zhǎng)下與吸光度呈線性相關(guān)。分光光度法較國(guó)標(biāo)規(guī)定的高錳酸鉀滴定法要簡(jiǎn)單易行，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤更小。
　　粗酶液以緩沖液從細(xì)胞破碎的鮮葉中進(jìn)行抽提，在制備過(guò)程中，鮮葉的研磨方法對(duì)酶活力具有顯著影響，勻漿機(jī)高速勻漿和手動(dòng)冰浴研磨酶活力顯著高于液氮研磨;離心速率和離心時(shí)間對(duì)酶活力無(wú)顯著性影響;聚乙烯吡咯烷酮(PVP)具有極顯

3、著的影響，當(dāng)PVP在鮮葉總重的10％以上時(shí)，CAT才能表現(xiàn)出較高的活力，反之，則CAT幾乎無(wú)活力;若對(duì)粗酶液做進(jìn)一步的除雜，包括過(guò)0.45μm濾膜和活性碳吸附，前者將使CAT的活力損失大部分，而后者則使CAT的活力全部消失;酶活力測(cè)定過(guò)程中，每3 mL反應(yīng)液中加入0.05 mL的粗酶液以及0.4mL的過(guò)氧化氫底物是最為理想的反應(yīng)體系，反應(yīng)時(shí)間以不高于5 min為佳;緩沖液為PBS或Tris-HCl溶液，離子濃度在0.1～0.2 M之間，

4、pH控制在7.2～7.8。
　　以優(yōu)化后的CAT活力測(cè)定方法，對(duì)茶樹(shù)不同條件下CAT活力變化規(guī)律進(jìn)行了研究。在相同地點(diǎn)種植的茶樹(shù)品種，春季，其新梢的酶活力差異不大，而到了夏季，不同品種間的CAT活力的差異性變大，進(jìn)入秋季，CAT活力普遍維持在較高水平，此時(shí)差異性又再次減小;不同季節(jié)，同一品種的茶樹(shù)過(guò)氧化氫酶活力差異變化顯著;總體上生長(zhǎng)在主干的鮮葉，其CAT活力要高于新生枝條上的鮮葉，而在同一枝條上，位于枝條中間的鮮葉，其CAT活力

5、要高于位于枝條兩端的鮮葉;剛采下來(lái)的茶樹(shù)鮮葉酶活力約在185 U/g，而在攤放2h之后，其酶活力上升了30％，而隨著攤放時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)至四小時(shí)，酶活力急劇下降，隨后酶活力一直低于初始活力，并在24 h之內(nèi)一直穩(wěn)定在100 U/g左右。
　　通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀和Sephacryl S-200HR凝膠樹(shù)脂柱層析后，茶樹(shù)鮮葉中CAT比活力提高了48.58倍。酶活力回收率達(dá)到了33.19％。通過(guò)SDS-PAGE分析，該樣品達(dá)到電泳純。<

6、br>　　茶樹(shù)鮮葉中CAT亞基蛋白分子量為50.9 kD，Km為7.6 mmol/L，最適反應(yīng)溫度為36℃，最適反應(yīng)pH為7.4。茶樹(shù)中CAT的耐熱性較好，50℃時(shí)，短時(shí)間內(nèi)，茶樹(shù)CAT活力略有下降，當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到60min時(shí)，CAT活力還剩56.3％;70℃時(shí)，茶樹(shù)CAT酶活力在10 min后還剩33.4％，而在1h后，酶活力低于10％，90℃條件下孵育10 min則完全失活。對(duì)酸堿的耐受性表現(xiàn)為對(duì)堿性的耐受性要強(qiáng)于對(duì)酸性的耐受性。在

7、pH10.0和pH9.0的緩沖液中孵育60min后，酶活力仍然分別保持了14.5％和37.3％;而pH為6.0、5.0、4.0時(shí)，孵育60min中后，酶活力則僅保持了15.7％、3.6％、3.6％。
　　對(duì)不同的抑制劑和激活劑的研究結(jié)果表明:不同的有機(jī)溶劑，對(duì)茶樹(shù)中CAT活力的影響效果是不一樣，甲醇只有在較高濃度時(shí)，才能對(duì)茶樹(shù)CAT活力產(chǎn)生抑制作用，而乙醇在較低濃度即對(duì)茶樹(shù)CAT活力產(chǎn)生了抑制作用。不同化合物對(duì)茶樹(shù)CAT活力的影響

8、是不同的，較低濃度的十二烷基硫酸鈉(SDS)即可使茶樹(shù)CAT大量失活;乙二胺四乙酸(EDTA)濃度在10～30 mmol/L范圍內(nèi)，CAT活力損失量與EDTA添加量呈正相關(guān)，EDTA含量繼續(xù)增加，CAT活力不再下降;尿素對(duì)茶樹(shù)CAT的影響相對(duì)較小，CAT酶活力始終保持在50％左右，未出現(xiàn)較大波動(dòng)。金屬離子對(duì)茶樹(shù)CAT活力的影響同樣表現(xiàn)出極大的差異性。Co2+、Zn2+對(duì)茶樹(shù)CAT活力起著激活的作用;K+、Mg2+對(duì)茶樹(shù)CAT活力的影響并