PPARγ在腦缺血再灌注損傷和過氧化氫損傷中的調(diào)控機制研究.pdf

1、研究目的:
　　1.建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型(in vivo),觀察12/15-脂氧酶產(chǎn)物12s-羥基二十四碳四烯酸(12s-hydroxyeicosatetraenoic,12s-HETE)對腦組織PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptorsg)表達(dá)及活性的影響,以及對炎癥的抑制作用,并初步探討12/15-脂氧酶(12/15-lipoxygenase,12/15-LOX)

2、途徑在缺血腦組織中調(diào)控PPARγ的意義。2.建立體外原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元氧糖剝奪(Oxygen-Glucose Deprivation,OGD)損傷模型(in vitro),觀察體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元在OGD損傷后,細(xì)胞內(nèi)12/15-脂氧酶、PPARγ的蛋白表達(dá)及活性變化;并多方法抑制12/15-脂氧酶或外源性給予12/15-脂氧酶產(chǎn)物(12s-HETE),觀察對OGD神經(jīng)元中PPARγ及其活性(靶基因表達(dá)、DNA結(jié)合活性等)的影響,

3、進而確定OGD神經(jīng)元中12/15-脂氧酶途徑對PPARγ的調(diào)控作用。3.建立體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元過氧化氫損傷模型,觀察過氧化氫損傷神經(jīng)元內(nèi)ERK1/2表達(dá)及激活、PPARγ表達(dá)、磷酸化修飾及活性變化;抑制ERK1/2激活對PPARγ的影響;以確定過氧化氫損傷神經(jīng)元中ERK1/2途徑對PPARγ的調(diào)節(jié)作用。
　　研究方法：
　　1.將大鼠隨機分為假手術(shù)組、缺血再灌注模型組、12s-HETE干預(yù)組。采用神經(jīng)功能缺損評分、TTC

4、染色評估12s-HETE對腦缺血再灌注(缺血60min/再灌注24小時）大鼠的損傷程度、梗死體積的影響；免疫組化、western blot技術(shù)檢測PPARγ、iNOS、活化Caspase3等的表達(dá)和活性。2.自孕18-21d SD雌性大鼠，進行胎鼠大腦皮層神經(jīng)元原代體外培養(yǎng)。至7d于倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)，以免疫熒光染色法對神經(jīng)元進行純度鑒定（MAP2表達(dá)）。建立氧糖剝奪再灌注損傷模型，倒置相差顯微鏡觀察不同OGD損傷組細(xì)胞形

5、態(tài)變化、MTT法測定細(xì)胞相對存活率。神經(jīng)元隨機分組為對照組和OGD損傷60min組、90min組和120min組（再灌注時間均為24小時）。分別提取總蛋白、漿蛋白和核蛋白，利用western blot、免疫熒光技術(shù)檢測各組神經(jīng)元中12/15-脂氧酶和PPARγ各成分蛋白表達(dá)的改變。依據(jù)實驗結(jié)果選取90min組神經(jīng)元作為OGD損傷組，同時應(yīng)用12/15-脂氧酶抑制劑或反義寡聚核苷酸抑制、給予12/15-脂氧酶產(chǎn)物12s-HETE等多方法干

6、預(yù)，對細(xì)胞中12/15-脂氧酶及PPARγ總蛋白、胞漿蛋白、胞核蛋白水平進行檢測，并進行 PPARγ的亞細(xì)胞表達(dá)定位；RT-PCR法檢測PPARγ靶基因（脂蛋白脂酶和乙酰輔酶A氧化酶）mRNA表達(dá)；構(gòu)建pGL3-PPRE質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染體外正常培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元細(xì)胞，熒光素酶含量檢測12s-HETE對PPAR?-DNA結(jié)合活性的影響。3.原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元，隨機分組為對照組和過氧化氫損傷組，MTT法觀察神經(jīng)元損傷以確定過氧化氫作用濃度。進行ER

7、K1/2、phospho-ERK1/2、PPARγ和phospho-PPARγ蛋白水平表達(dá)的時程研究，同時對PPARγ的核移位和亞細(xì)胞定位進行檢測；應(yīng)用多種ERK1/2激活抑制劑，檢測對過氧化氫損傷神經(jīng)元內(nèi)PPARγ表達(dá)和活性的影響。
　　實驗結(jié)果：
　　1.與假手術(shù)組相比較，缺血再灌注損傷組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著增加，平均腦梗死體積為30.24％；腦組織內(nèi) PPARγ總蛋白表達(dá)水平明顯增高，胞漿PPARγ蛋白顯著下降、胞

8、核PPARγ蛋白顯著增加；iNOS（NOS2）表達(dá)水平顯著增高，活化caspase3表達(dá)水平顯著增高。與缺血再灌注組相比較，12s-HETE干預(yù)使大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低，腦梗死體積明顯縮小；PPARγ總蛋白表達(dá)水平進一步增高，胞漿PPARγ蛋白進一步下降、胞核PPARγ蛋白進一步增加；同時使iNOS表達(dá)水平顯著下降，活化caspase3表達(dá)水平顯著下降。
　　2.體外原代培養(yǎng)7d的大鼠皮層神經(jīng)元，形態(tài)飽滿，突起豐富，相互交織成網(wǎng)

9、絡(luò)，神經(jīng)元 MAP2陽性率＞95%，可視為比較純的神經(jīng)元培養(yǎng)。體外原代培養(yǎng)7d大鼠皮層神經(jīng)元，OGD損傷60min、90min和120min（再灌注24小時），光鏡下形態(tài)學(xué)均出現(xiàn)損傷性改變；MTT法測定神經(jīng)元細(xì)胞相對存活率降低，分別為61.34±3.14%、43.84±2.07%、15.18±2.32%。Western blot和免疫熒光檢測顯示：與正常對照組神經(jīng)元相比較，OGD損傷組神經(jīng)元PPARγ總蛋白表達(dá)顯著增加，胞漿PPARγ顯

10、著下降、胞核PPARγ顯著增加；12/15-LOX蛋白表達(dá)顯著增加。與OGD損傷組神經(jīng)元相比較，12/15-LOX抑制劑 Baicalein(5μM、10μM)或12/15-LOX反義寡聚核苷酸處理組神經(jīng)元，12/15-LOX和PPARγ蛋白水平均有顯著下降，胞漿PPARγ輕度或顯著增加、胞核PPARγ顯著下降。RT-PCR法檢測：與OGD損傷組相比，12s-HETE處理使神經(jīng)元內(nèi)PPARγ靶基因脂蛋白脂酶和乙酰輔酶A氧化酶mRNA水平

11、顯著增加。pGL3-PPRE質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞，12s-HETE處理使熒光素酶活性明顯增加。
　　3.體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元，進行過氧化氫（50μM、200μM、500μM）處理。光鏡下觀察：過氧化氫50μM處理組神經(jīng)元損傷較輕，過氧化氫500μM處理組神經(jīng)元損傷最為顯著，但神經(jīng)元死亡過多；MTT法計算神經(jīng)元相對存活率分別為過氧化氫50μM組75.25±3.31%、200μM組53.84±2.42%、500μM組21.1

12、8±1.33%，選用過氧化氫200μM作為后續(xù)實驗處理濃度。Western blot檢測顯示：過氧化氫處理0~24h神經(jīng)元ERK1/2總蛋白無顯著變化，phospho-ERK1/2于過氧化氫處理約0.5h~3h內(nèi)顯著上調(diào)，之后迅速下降至基礎(chǔ)表達(dá)水平；PPARγ總蛋白在過氧化氫處理0~3h神經(jīng)元中表達(dá)無顯著變化，6h~24h顯著下降；phospho-PPARγ于過氧化氫處理約0.5h~3h時顯著上調(diào)，之后開始下降，但6h組仍高于0h組，1

13、2h~24h蛋白表達(dá)水平顯著降低。核移位檢測顯示：與正常對照組神經(jīng)元（0h組）相比較，過氧化氫損傷0.5h、3h組神經(jīng)元PPARγ胞漿蛋白水平均顯著上升，同時胞核蛋白水平均顯著下降。與過氧化氫處理組相比較，ERK1/2抑制劑 U0126或 PD98059處理組神經(jīng)元 phospho-ERK1/2和phospho-PPARγ蛋白水平均顯著下降，神經(jīng)元 PPARγ胞漿蛋白水平減少、胞核蛋白水平顯著增加。
　　研究結(jié)論：
　　1.

14、12/15-LOX產(chǎn)物12s-HETE促進缺血再灌注損傷大鼠腦組織PPAR?的表達(dá)和核移位，同時抑制缺血再灌注損傷腦組織中炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和促凋亡因子表達(dá)，具有腦保護作用。初步推測，12s-HETE的這種腦保護作用可能是通過對PPAR?的激活實現(xiàn)的。進一步推測在缺血再灌注損傷腦組織中，可能存在12/15-LOX途徑對PPARγ的激活調(diào)控作用。
　　2.體外原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元 OGD損傷誘導(dǎo)神經(jīng)元12/15-LOX和PPARγ表達(dá)

15、上調(diào)及活性增加；12/15-LOX選擇性抑制劑和反義寡聚核苷酸可顯著抑制OGD誘導(dǎo)的12/15-LOX和PPARγ改變；12/15-LOX產(chǎn)物12s-HETE可顯著上調(diào)OGD誘導(dǎo)的12/15-LOX和PPARγ改變，同時增加PPARγ轉(zhuǎn)錄活性。推測在體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元 OGD損傷中，存在12/15-LOX途徑對 PPARγ的激活調(diào)控作用。
　　3.體外原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元，過氧化氫引起 PPARγ磷酸化修飾和PPARγ表達(dá)下