重組干酪乳桿菌分泌表達(dá)豬輪狀病毒VP4蛋白和VP4-LTB融合蛋白及其免疫效果分析.pdf

1、豬輪狀病毒(PorcineRotarirus，PRY)屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，是引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原之一。該病是典型的糞-口傳染，針對其黏膜感染特點(diǎn)，研制有效的刺激黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生局部免疫應(yīng)答，進(jìn)一步引起全身性系統(tǒng)免疫反應(yīng)的疫苗，對該病的防治具有重要意義。LTB為大腸桿菌不耐熱腸毒素的結(jié)合亞單位，無毒素活性，可以與多種蛋白抗原或非蛋白抗原經(jīng)不同免疫途徑共同免疫機(jī)體，可增強(qiáng)機(jī)體的系統(tǒng)免疫及黏膜免疫應(yīng)答，同時(shí)，還能消除機(jī)體對免疫

2、原的耐受，誘發(fā)長期免疫記憶。 本研究以豬輪狀病毒感染與免疫特點(diǎn)和乳酸菌的腸道益生作用、佐劑效應(yīng)、非特異性抗菌、抗感染特點(diǎn)，設(shè)計(jì)利用干酪乳桿菌LactobacilluscaseiATCC393(L.casei393)作為遞旱抗原的活菌載體，以VP4(豬輪狀病毒的主要保護(hù)性抗原)和VP4-LTB(VP4與大腸桿菌不耐熱腸毒素的B亞單位相連接)為目的基因，插入到分泌表達(dá)型的乳酸桿菌中，構(gòu)建表達(dá)了豬輪狀病毒主要免疫保護(hù)性抗原VP4的重組

3、干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)和共表達(dá)VP4-LTB的重組干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)，分析比較了這兩種重組干酪乳桿菌的免疫原性。 以豬輪狀病毒VP4基因的前756bp的質(zhì)粒VP4-pGEX-6P-1為模板，根據(jù)表達(dá)載體融合表達(dá)位點(diǎn)及干酪乳桿菌密碼子使用的偏嗜性，應(yīng)用oligo6.0軟件設(shè)計(jì)引物P1-P2，經(jīng)PCR擴(kuò)增出約756bp的目的基因VP4，將VP4基因片段克隆到pMD18-Tsimple載體，并進(jìn)行了酶切、PCR鑒定和序列測定，重組質(zhì)粒命名

4、為pMD18-T-VP4。重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切，回收目的基因片段VP4與經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體pPG-2連接，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)L.casei393，篩選陽性克隆，并進(jìn)行酶切、PCR和測序鑒定，重組質(zhì)粒命名pPG-2-VP4，重組干酪乳桿菌命名為pPG-2-VP4/L.casei393。同時(shí)，以質(zhì)粒pMD18-T-LTB為模板，以同樣方法設(shè)計(jì)引物P3-P4，擴(kuò)增出約375bp的目的基因LTB，再將LTB進(jìn)行SalI和XhoI雙

5、酶切，回收的目的基因片段LTB與經(jīng)過XhoI單切的質(zhì)粒pMD18-T-VP4連接，用引物P1-P4擴(kuò)增出目的片段VP4-LTB，再將其與pMD18-Tsimple載體鏈接，并進(jìn)行酶切、PCR鑒定和序列測定篩選出陽性質(zhì)粒命名為pMD18-T-VP4-LTB，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后電轉(zhuǎn)化L.casei393，鑒定后重組質(zhì)粒命名pPG-2-VP4-LTB，重組干酪乳桿菌命名為pPG-2-VP4-LTB/L.casei393。

6、 將獲得的兩種重組干酪乳桿菌以2％乳糖為誘導(dǎo)劑進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。重組干酪乳桿菌經(jīng)誘導(dǎo)后的SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，有約27kD和40kD的融合蛋白得到了表達(dá)，表達(dá)蛋白的大小與理論值相符。Westernblot結(jié)果分析表明，表達(dá)的蛋白可被PRY抗血清所識(shí)別，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所表達(dá)的蛋白能夠在干酪乳桿菌菌體表面檢測到：為了證明兩株重組干酪乳桿菌系統(tǒng)作為活菌疫苗潛在的應(yīng)用價(jià)值，以及LTB的粘膜免疫作用，本實(shí)驗(yàn)以BAL

7、B/c小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。免疫程序?yàn)椋簩?shí)驗(yàn)鼠口服接種109活菌量，每隔2w免疫一次，共免疫三次，每次連續(xù)免疫3d，一天免疫一次。同時(shí)，以口服空載體干酪乳桿菌為陰性對照。免疫后分別測定了小鼠糞便、陰道粘液、淚液、乳汁樣品中抗VP4分泌型IgA及小鼠血清樣本中抗VP4的特異性IgG水平。ELISA檢測結(jié)果表明，口服免疫重組干酪乳桿菌后在小鼠糞便、陰道黏液、淚液、乳汁中均檢測到了特異性sIgA，而且VP4-LTB共表達(dá)菌株在誘導(dǎo)s

8、IgA抗體水平和持續(xù)時(shí)間都明顯優(yōu)于單獨(dú)表達(dá)VP4的重組菌。但共表達(dá)菌株和單獨(dú)重組菌的血清樣本檢測結(jié)果表明，雖然二者均能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高IgG抗體，但抗體水平無明顯差別。通過脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及IL-4、IFN-r的測定結(jié)果表明，所構(gòu)建的重組干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)可誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞免疫應(yīng)答。 采用病毒中和實(shí)驗(yàn)檢測針對豬輪狀病毒免疫保護(hù)性抗原VP4產(chǎn)生抗體的病毒中和能力。結(jié)果表明重組菌pPG-2-VP4/L.casei393血清抗體中和效價(jià)為1: