與豬輪狀病毒VP6蛋白相互作用的細胞蛋白研究.pdf

1、豬輪狀病毒(PoRV)是引起幼齡仔豬發(fā)生急性胃腸炎的主要病原，一般通過接觸病畜的排泄物后經糞口途徑進行傳播，呈地方性流行。目前在我國流行范圍較廣的是A群PoRV，在豬群中流行率為3.3％～67.3％，其中G9型毒株呈再度流行趨勢。PoRV單純感染或與其它病原（豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬圓環(huán)病毒等）混合感染，直接或間接地影響豬群生產力，嚴重制約了我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，造成巨大經濟損失。因此，深入了解PoRV在機體內的復制過程

2、，研究病毒蛋白與宿主蛋白之間的相互作用機制，對于有效控制疫病流行、降低對養(yǎng)豬業(yè)的危害極為迫切和重要。
　　本研究將實驗室分離的Rotavirus A pig/China/NMTL/2008/G9P[23]毒株（簡稱NMTL株）作為研究對象，該毒株對豬有較強致病力，豬也是輪狀病毒主要的儲存宿主，存在動物病原傳染給人的潛在危險，因此具有重要的研究價值。PoRV VP6蛋白是病毒粒子最主要的結構蛋白，位于病毒粒子三層衣殼結構的中間層。它

3、與病毒脫殼釋放至胞漿中的雙層病毒粒子(DLPs)的轉錄活性有關。根據(jù)研究報道，VP6蛋白在病毒感染細胞中與不同細胞蛋白發(fā)生一系列相互作用，在病毒的復制過程中起關鍵作用，但對參與這個過程的細胞蛋白以及有關功能仍不十分清楚。
　　在本研究中，采用RT-PCR方法擴增出PoRVNMTL株VP6基因cDNA全長，將VP6 PCR產物克隆至原核表達載體pGEX-6P-1中，并轉化至DH5α感受態(tài)細胞，獲得pGEX-PoRV-VP6重組質粒，

4、測序正確后轉化至大腸桿菌表達菌BL21(DE3)，IPTG誘導融合蛋白表達，獲得GST-VP6重組蛋白。利用GST pull-down技術和MALDI-TOF/TOF質譜分析鑒定，發(fā)現(xiàn)了3種與PoRV VP6蛋白存在相互作用的細胞蛋白，分別是:β-肌動蛋白(beta-actin)、原肌球蛋白1型(TPM1)以及40S核糖體蛋白S16(RPS16)，并通過免疫共沉淀(Co-IP)試驗加以驗證。此外，還對PoRV VP6蛋白與β-肌動蛋白相

5、互作用進行了后續(xù)研究:用siRNA干擾敲低細胞β-肌動蛋白表達量后，感染PoRV，用western blot方法檢測細胞裂解物中VP6蛋白表達量變化，用高通量內涵篩選系統(tǒng)檢測釋放至培養(yǎng)液上清中病毒的感染率。通過熒光定量qRT-PCR方法，檢測接毒后不同時間釋放至培養(yǎng)液上清中的病毒含量，確定PoRV一輪復制周期所需時間。結合電鏡觀察和VP6蛋白表達量檢測結果，確定PoRV的不同復制階段。分別在PoRV不同復制階段（接毒后0h/2h/4h/

6、6h），用肌動蛋白聚合抑制劑CytoD處理感染細胞，用熒光定量qRT-PCR方法檢測接毒后8h釋放至培養(yǎng)液上清中的病毒含量差異，確定抑制肌動蛋白聚合作用對PoRV增殖釋放的影響。雙免疫熒光染色后在共聚焦顯微鏡下觀察PoRVVP6蛋白與β-肌動蛋白在感染細胞中是否共定位，用免疫電鏡觀察PoRV VP6蛋白在細胞內的運送途徑。用氯化銫不連續(xù)密度梯度離心方法制備PoRV DLPs，通過肌動蛋白結合蛋白(ABPs) spin-down試驗確定P

7、oRV DLPs能否在體外增強肌動蛋白的聚合作用。
　　通過以上研究發(fā)現(xiàn)，β-肌動蛋白、原肌球蛋白1型、40S核糖體蛋白S16，是PoRV感染過程中與VP6蛋白相互作用的細胞蛋白。這3種蛋白廣泛存在于各種組織細胞中，在各物種進化過程中高度保守，病毒在體內增殖，利用容易獲得的細胞蛋白，有助于增強病毒對細胞的適應性，擴大病毒感染的組織范圍，也為RV的跨種間傳播提供了可能。
　　用PoRV感染siRNA干擾敲低β-肌動蛋白表達量的

8、細胞，病毒VP6蛋白合成和病毒粒子釋放顯著降低。MA104細胞經siACTB轉染72h后，感染PoRV NMTL株48h，細胞裂解物中PoRVVP6蛋白表達量與對照組相比顯著降低;將上述處理后收集到的上清樣品感染MA104細胞18h后，siACTB處理組PoRV感染陽性細胞數(shù)量，明顯少于未處理組、Mock組、siFAM組等對照組。以上研究證實，PoRV VP6與β-肌動蛋白相互作用，能夠有效介導病毒感染，在胞漿中運輸DLPs、起始mRN

9、A轉錄翻譯合成病毒蛋白、組裝和釋放TLPs過程中起重要作用。
　　雙免疫熒光染色實驗發(fā)現(xiàn)，帶有不同熒光標記的PoRV VP6蛋白和β-肌動蛋白，在病毒感染細胞的胞漿中共定位。免疫電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在PoRV感染早期，帶有膠體金標記的VP6蛋白位于肌動蛋白微絲上，此后VP6蛋白分布于感染細胞核糖體、線粒體、內質網、細胞核中。研究結果表明，PoRV DLPs在感染細胞中依賴肌動蛋白網絡結構，運送至細胞內的特定位置進行復制。這些發(fā)現(xiàn)揭示了P

10、oRV VP6蛋白在感染細胞內的運輸途徑，以及參與PoRV復制的細胞成分。
　　ABPs spin-down試驗體外證實，PoRV VP6蛋白結合至肌動蛋白微絲上，但DLPs并不能增強肌動蛋白的聚合活性。通過這2種蛋白之間的相互作用，PoRV DLPs劫持了細胞的肌動蛋白骨架系統(tǒng)，使它在細胞中像“貨物”一樣被運輸至特定的細胞器中，以便于病毒復制。但在體內PoRV感染過程中，VP6蛋白是否招募其它宿主細胞蛋白（如:本研究已證實的VP