G9型豬輪狀病毒VP2-4-6-7蛋白真核表達(dá)及組裝病毒樣顆粒研究.pdf

1、豬輪狀病毒(Porcine Rotavirus，PRV)屬于呼腸孤病毒科、輪狀病毒屬，是引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原之一。小日齡動(dòng)物最為易感，人、豬、火雞、綿羊等多種動(dòng)物都是輪狀病毒的自然宿主。輪狀病毒引起的腹瀉是一種世界性疾病，給人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重危害。 目前，雖然有PRV疫苗可用于該病的預(yù)防，但還未有效控制該病流行，迫切需要研制新型疫苗和探索新的免疫機(jī)制來(lái)預(yù)防和控制PRV感染發(fā)病。病毒樣顆粒(Virus-like

2、particles，VLPs)在病毒形態(tài)上與真正病毒相同或相似，具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，在疫苗研究上有廣闊應(yīng)用前景。國(guó)外已經(jīng)有成功組裝PRV VLPs的研究報(bào)道，且在疫苗研究、動(dòng)物免疫試驗(yàn)中都取得了可喜的成果，為本實(shí)驗(yàn)提供了切實(shí)可行的理論依據(jù)。 本研究參考GenBank已發(fā)表的PRV G5型OSU毒株VP4/6/7全長(zhǎng)基因組序列和5株人源PRV VP2全長(zhǎng)基因序列，分別設(shè)計(jì)合成4對(duì)引物對(duì)我國(guó)江蘇分離的PRV毒株(簡(jiǎn)稱JS毒

3、株)，采用RT-PCR方法擴(kuò)增全基因片段，為了對(duì)VP2基因進(jìn)行生物學(xué)特性分析，因此又?jǐn)U增完成了OSU毒株VP2全基因片段。將擴(kuò)增基因分別克隆到pMD18-T載體，篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果顯示：JS毒株與OSU毒株VP2全基因序列均為2717bp，編碼890個(gè)氨基酸，同源性比較發(fā)現(xiàn)二者核苷酸同源性為99.9％，氨基酸同源性為99.91％，雖然二者與人wa毒株VP2基因同源性最高，但通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)其與豬源HP140毒

4、株的親緣關(guān)系最近；VP4基因全長(zhǎng)2342 bp，編碼776個(gè)氨基酸，15株P(guān)RV A群VP4全基因序列進(jìn)行同源性比較，核苷酸同源性分別在69.2～99.5％，推導(dǎo)氨基酸同源性在70.2～99.1％之間，氨基酸45～250位變異率較高，有突變、插入和缺失現(xiàn)象，其中胰酶作用位點(diǎn)氨基酸241、247位高度保守，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，JS毒株與OSIJ、JL94毒株親緣關(guān)系最近；VP6全基因序列1320bp，編碼389個(gè)氨基酸，9株P(guān)RV VP6

5、全基因同源性比較，核苷酸同源性在77.1％～91.1％之間，氨基酸的同源性在89.7％～99.5％之間，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，10株P(guān)RV可以分為4個(gè)群，JS毒株與B131、OSU、CN86毒株親緣關(guān)系較近，為一個(gè)群；VP7基因全長(zhǎng)1062bp，編碼326個(gè)氨基酸，與已知的15個(gè)毒株VP7全長(zhǎng)基因的核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列比較，同源性分別為74.5％～78.5％和175.2％～83.1％之間，核苷酸系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JS毒株與RV

6、G9型參考毒株ICB2185、O-1親緣關(guān)系較近，為一個(gè)進(jìn)化群，表明JS毒株血清型為G9型。根據(jù)測(cè)序結(jié)果重新設(shè)計(jì)合成另4對(duì)引物，上游均含BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)，下游均含Sal Ⅰ酶切位點(diǎn)的，以鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增目的片段后，分別克隆至真核表達(dá)載體pFastBac的BamH Ⅰ、Sal Ⅰ之間的多克隆位點(diǎn)。經(jīng)酶切、PCR和序列測(cè)定鑒定止確后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，在其轉(zhuǎn)座酶作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)座，得到Bacmid-VP2/4

7、/6/7重組基因組。純化后與脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，72小時(shí)后收獲重組病毒，盲傳3代后提取重組病毒DNA進(jìn)行PCR鑒定。SDS-PAGE、Western blot分析，表明PRV JS毒株VP2、VP4蛋白獲得表達(dá)并具有良好的生物學(xué)特性。 為了研究PRV VLP的形態(tài)學(xué)特性，VP2重組病毒單獨(dú)轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，培養(yǎng)物上清經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化后，電鏡負(fù)染觀察到直徑約40nm左右的核心樣顆粒，在形態(tài)、直徑大小上都接近真實(shí)的病毒粒子。