食管鱗狀細(xì)胞癌HLA-I抗原基因啟動(dòng)子甲基化與其臨床病理學(xué)特點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[研究背景及目的]：食管鱗狀上皮細(xì)胞癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率居各種惡性腫瘤第三位。雖然針對(duì)食管腫瘤的治療如手術(shù)治療及放化治療都得到長(zhǎng)足的進(jìn)步，但其預(yù)后仍較差。其五年生存率只有20-36％。目前針對(duì)腫瘤的基因治療正成為研究的熱點(diǎn)，其中關(guān)于腫瘤基因甲基化與其表達(dá)的缺失是研究的熱點(diǎn)之一。
　　 DNA甲基化是人類后成論學(xué)說的主要復(fù)制后修飾方式，它通常發(fā)生在胞嘧啶和鳥嘌呤的(CpG)二核苷酸中的胞嘧啶殘基上。多種基

2、因的啟動(dòng)子區(qū)和第一外顯子富含CpG，而CpG相對(duì)集中的區(qū)域稱為CpG島，生理情況下，CpG島多為非甲基化，散在的CpG為甲基化。DNA甲基化不僅在胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化過程中起著關(guān)鍵作用，而且在癌變過程中扮演著重要角色。早期的研究曾強(qiáng)調(diào)DNACpG位點(diǎn)異常低甲基化促使癌基因表達(dá)，從而使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。近年來研究發(fā)現(xiàn)在多種人類腫瘤基因組中，廣泛低甲基化和部分區(qū)域的高甲基化共存是DNA甲基化水平的特征。5端CpG島甲基化致抑癌基因失活是引起細(xì)胞惡

3、性轉(zhuǎn)化的重要步驟。因此，DNA甲基化的改變通過影響癌基因和抑癌基因的表達(dá)而參與癌的發(fā)生，在腫瘤發(fā)生過程中，甲基化模式發(fā)生逆轉(zhuǎn)，相關(guān)基因的甲基化紊亂發(fā)生率很高。近年來，人們通過對(duì)幾種癌組織、癌旁組織和正常組織DNA的分析，證實(shí)某些癌基因(如H—Ras，c～Mye)低甲基化和抑癌基因(如p16，Rb)的高甲基化改變是細(xì)胞癌變的一個(gè)重要特征。同時(shí)甲基化狀態(tài)的改變與基因點(diǎn)突變、基因缺失及基因表達(dá)異常的發(fā)生密切相關(guān)。食管癌的發(fā)病是多因素多環(huán)節(jié)作用

4、的結(jié)果，機(jī)體的免疫監(jiān)視功能在其中起重要作用。機(jī)體清除突變及惡性細(xì)胞主要依賴于細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CDcell)及自然殺傷細(xì)胞(NKcell)，但需要組織相容復(fù)合物(MHC)遞呈信號(hào)及細(xì)胞間粘附分子參與。
　　 人類白細(xì)胞抗原(HLA)是免疫系統(tǒng)中的重要分子。它參與機(jī)體遞呈抗原，決定免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的識(shí)別和殺傷，它與腫瘤的關(guān)系一直受到關(guān)注。人體組織細(xì)胞惡變后，其表面的HLAⅠ類基因抗原呈現(xiàn)不同程度的丟失，抗原性降低，致使機(jī)體免疫系統(tǒng)無

5、法識(shí)別及清除，導(dǎo)致惡變細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，但此抗原下調(diào)的分子機(jī)理尚不清楚基因的突變，轉(zhuǎn)錄調(diào)解和蛋白運(yùn)輸?shù)仍S多環(huán)節(jié)都有可能參與惡性腫瘤HLAⅠ類基因分子失活的調(diào)節(jié)。HLAⅠ類基因定位6P21，對(duì)此抗原基因的分析發(fā)現(xiàn)其基因促進(jìn)子區(qū)域均包含有CpG島（C為胞嘧啶，G為鳥嘌呤，p為甲基化）正常食管癌上皮中沒有發(fā)現(xiàn)該基因甲基化，提示HLA-Ⅰ類基因的甲基化可能是導(dǎo)致該抗原表達(dá)下調(diào)的關(guān)鍵機(jī)理。一些研究在試管內(nèi)用去甲基化試劑52糖胞苷對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并

6、用該試劑治療黑色素瘤，結(jié)果癌細(xì)胞出現(xiàn)了該抗原表達(dá)上調(diào)，不僅進(jìn)一步證明了HLA-Ⅰ類基因甲基化在調(diào)控該基因抗原中的作用，也為腫瘤分子免疫研究及治療提供了新的靶點(diǎn)。
　　 在本實(shí)驗(yàn)中，我們研究證實(shí)啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致的基因沉默是一個(gè)可以逆轉(zhuǎn)的基因修飾過程，且啟動(dòng)子去甲基化可直接恢復(fù)抑癌基因功能。因此改變基因表觀遺傳學(xué)代表了一種新的臨床治療腫瘤的方法。盡管目前只有在食管鱗癌細(xì)胞系中證實(shí)DNA甲基化酶抑制劑可恢復(fù)沉默的腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，抑

7、制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。由于DNA甲基化酶抑制劑無基因特異性，且不良作用大甚至可能導(dǎo)致基因突變等毒副作用。因此，需研究和開發(fā)更加安全有效的DNA甲基化酶抑制劑。
　　 [研究方法]：
　　 選取山東大學(xué)第二醫(yī)院1999-2004年手術(shù)切除的食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本87例，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法，利用抗HLA-Ⅰ類抗原的單克隆抗體(EMR8-5)及抗TAP1，LMP2的單克隆抗體(分別為TO-1和SY-1)，使用通用IHC試劑盒染色

8、，按照第12屆國(guó)際組織相容性大會(huì)上確定的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，研究這三種分子在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與分布情況，并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，探討HLA-Ⅰ類分子與臨床病理學(xué)結(jié)果的關(guān)系，以及APM相關(guān)分子在HLA-Ⅰ類分子表達(dá)過程中的作用。第二步采用甲基化特異性PCR方法分別檢測(cè)87例食管癌組織及癌旁組織中HLA-Ⅰ基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化狀態(tài)。通過統(tǒng)計(jì)方法分析基因啟動(dòng)子甲基化與病理學(xué)特點(diǎn)關(guān)系。
　　 [研究結(jié)果]：
　　 HLA-Ⅰ類分子

9、表達(dá)在細(xì)胞膜上，LMP2及TAP1表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。與正常食管粘膜相比，腫瘤組織HLA-Ⅰ、TAP-1、LMP-2存在明顯表達(dá)下調(diào)或者缺失，原發(fā)灶中這三種分子表達(dá)缺失比例分別為為67.0％，29.8％，47.0％。HLA-Ⅰ類分子啟動(dòng)子甲基化率70.1％，而正常食管組織中表達(dá)率僅為3.6％(p＜0.01)。TAP1與LMP2表達(dá)下調(diào)或者缺失與HLA-Ⅰ類分子表達(dá)異常有關(guān)(P＜0.05)。HLA-Ⅰ類分子啟動(dòng)子甲基化與食管癌的分化程度、侵潤(rùn)