膀胱移行細(xì)胞癌Wnt信號通路抑制因子1基因啟動子甲基化狀態(tài)的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、Wnt 信號通路廣泛地涉及到機(jī)體的發(fā)育過程與腫瘤的發(fā)生。目前有關(guān)Wnt 信號通路的研究主要集中于Wnt 下游信號的異常表現(xiàn)，如β-catenin，APC，GSK-3β，CTNNB1及axin基因突變等。而對于Wnt 信號通路的上游信號(Wnt蛋白及其抑制物等)的異常改變與腫瘤發(fā)生的關(guān)系的研究相對較少。Wnt蛋白的表達(dá)在膀胱尿路上皮惡變過程中明顯增加：淺表性膀胱腫瘤高于正常膀胱粘膜，而且明顯高于侵襲性膀胱癌，這提示W(wǎng)nt 信號通路與膀胱癌

2、發(fā)生有關(guān)。而Wnt 信號通路下游分子，如APC和β-catenin的遺傳學(xué)改變在膀胱癌中比較少見。因此，我們推測膀胱癌Wnt 信號通路上游水平的異常改變可能是激活該通路的主要原因。WIF-1 (Wnt inhibitory factor-1)是Wnt 信號通路抑制物之一，它可通過直接與Wnt 信號蛋白結(jié)合而抑制Wnt 信號通路。膀胱癌WIF-1表達(dá)下調(diào)，但其機(jī)制及其生物學(xué)效應(yīng)尚不清楚。
　　 一．目的：
　　 1.探討膀

3、胱癌Wnt 信號途徑上游關(guān)鍵調(diào)控分子WIF-1 啟動子甲基化是否為抑制WIF-1 表達(dá)的主要原因；研究WIF-1 重新表達(dá)后對膀胱癌細(xì)胞的影響。
　　 2.探討WIF-1的重表達(dá)與喜樹堿細(xì)胞毒性之間的關(guān)系，觀察膀胱癌WIF-1基因重表達(dá)后HCPT 抗癌效應(yīng)的變化，探討5-aza-dc與HCPT 可能協(xié)同作用的機(jī)制。
　　 3.探討WIF-1 啟動子甲基化狀態(tài)與膀胱癌的臨床病理關(guān)系，進(jìn)一步明確WIF-1啟動子甲基化與膀胱癌

4、的關(guān)系，分析WIF-1 甲基化可否作為判斷膀胱癌患者的預(yù)后以及早期診斷的分子標(biāo)志物。
　　 二．方法：
　　 1．通過RT-PCR檢測Wnt1，Wnt5a,Wnt10b和Wnt13的mRNA在膀胱癌細(xì)胞株BIU87和T24的表達(dá)情況；通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測Wnt1在正常膀胱上皮和膀胱癌的表達(dá)情況；
　　 2．通過RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)以及Western-blot 等方法檢測膀胱癌細(xì)胞株BIU87和T24的W

5、IF-1的表達(dá)情況。
　　 3．甲基化抑制劑5-aza-dc處理膀胱癌細(xì)胞株BIU87和T24，通過甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測膀胱癌細(xì)胞WIF-1基因在5-aza-dc處理前后的甲基化狀態(tài)的變化；
　　 4．5-aza-dc處理膀胱癌細(xì)胞BIU87和T24 后，通過MTT 法，流式細(xì)胞儀分析(Annexin Ⅴ/PI 雙染法)和TUNEL 法檢測膀胱癌細(xì)胞的生長抑制及凋亡情況；
　　 5．不同濃度的5-

6、aza-dc和羥基喜樹堿聯(lián)合處理膀胱癌細(xì)胞株BIU87、T24 以及體外原代培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞，通過MTT 法檢測它們的細(xì)胞毒性。等效線圖解法分析它們的聯(lián)合效應(yīng)；
　　 6．流式細(xì)胞儀分析(Annexin Ⅴ/PI 雙染法)和TUNEL 法檢測5-aza-dc和羥基喜樹堿對膀胱癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)；RT-PCR 法檢測兩藥聯(lián)合作用時對WIF-1表達(dá)的影響；
　　 7．MSP 法檢測膀胱癌組織，正常膀胱組織以及腺性膀胱炎組織標(biāo)

7、本的WIF-1 甲基狀態(tài)；免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測上述組織WIF-1蛋白表達(dá)情況。SPSS12.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 三．結(jié)果：
　　 1.BIU87和T24的Wnt 表達(dá)情況不盡相同：它們均不表達(dá)Wnt1；均表達(dá)Wnt13；
　　 BIU87 不表達(dá)Wnt5a，但T24 表達(dá)；Wnt1在不同分化程度的膀胱癌以及正常膀胱上皮中均不表達(dá)；
　　 2．正常培養(yǎng)條件下的膀胱癌細(xì)胞株BIU87和T24 均不表達(dá)W

8、IF-1。在5-aza-dc(5μM)作用72小時后，BIU87和T24 均表達(dá)WIF-1。
　　 3.MTT 法顯示5-aza-dc 對膀胱癌細(xì)胞有明顯的生長抑制作用，與空白對照組比較，差異有顯著性意義(p<0.05)，兩株膀胱癌細(xì)胞T24和BIU87 之間無顯著性差異。
　　 5-aza-dc作用72小時后的兩種膀胱癌細(xì)胞株的凋亡率，與空白對照組比較有顯著性差異。
　　 4．WIF-1 mRNA的表達(dá)不受HC

9、PT的影響，而且HCPT 單獨(dú)作用于膀胱癌細(xì)胞并不能恢復(fù)WIF-1的表達(dá)。
　　 5．5-aza-dc和HCPT 對膀胱癌細(xì)胞有劑量依賴性細(xì)胞毒性(p<0.01)，兩藥產(chǎn)生了明顯的協(xié)同作用；而且2種膀胱癌細(xì)胞株與原代培養(yǎng)的3 株膀胱癌細(xì)胞表現(xiàn)出類似的效果。WIF-1 重表達(dá)后可以增加HCPT 誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞的凋亡。
　　 6．WIF-1 啟動子甲基化陽性率腫瘤分級的增加逐漸升高(G1、G2、G3 級分別為20.0[％]、

10、56.3[％]和86.7[％])，組間比較有顯著性差異(p<0.05)；淺表性和浸潤性腫瘤的WIF-1 啟動子甲基化陽性率也有顯著性差異(P<0.05)。通過Kaplan Meier分析顯示W(wǎng)IF-1 啟動子甲基化與未甲基化兩組之間的5年總生存率分別為60.6[％]和91.7[％](p<0.05)。
　　 7．正常膀胱組織的WIF-1蛋白表達(dá)率為92.3[％]；腺性膀胱炎的WIF-1蛋白表達(dá)率為85[％]，兩者之間無明顯差異(p

11、>0.05)。膀胱癌組織WIF-1蛋白總體表達(dá)率為30.1[％],明顯低于正常膀胱和腺性膀胱炎的表達(dá)率(P<0.01)。WIF-1在淺表性和浸潤性腫瘤組織中的表達(dá)有顯著性差異(p<0.05)，而且隨腫瘤分級的增加WIF-1陽性表達(dá)率逐漸降低，高分化與低分化腫瘤之間差異非常明顯(P<0.01)。
　　 四．結(jié)論：
　　 1．膀胱癌WIF-1基因啟動子甲基化是抑制WIF-1 表達(dá)的主要機(jī)制；
　　 2．WIF-1基因