早期胚胎細(xì)胞中HBs和HBx基因的表達(dá)與其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的關(guān)系.pdf

1、【背景與目的】：
　　乙型肝炎是世界各國尤其是我國當(dāng)前面臨的重大公共衛(wèi)生問題,因此其傳播途徑,發(fā)病機(jī)制及診療手段的研究一直是各國政府和科學(xué)家關(guān)注的課題。已有研究證實(shí),乙肝病毒(HBV)基因能夠整合到人精子染色體中,由精子帶入受精卵的HBV基因能夠在早期胚胎細(xì)胞中復(fù)制與表達(dá),但其分子機(jī)制尚不清楚。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)修飾的一個(gè)重要內(nèi)容,在早期胚胎發(fā)育中起重要的調(diào)節(jié)作用。它也是細(xì)胞調(diào)控宿主基因表達(dá)和進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病毒基因表達(dá)的重要方

2、式。HBV感染可導(dǎo)致宿主細(xì)胞表觀遺傳修飾異常,誘發(fā)染色體不穩(wěn)定,進(jìn)而影響胚胎的正常發(fā)育,整合在宿主基因組中的HBV基因?qū)⒃黾釉l(fā)性肝癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。本課題的目的是通過研究HBV基因在精子、早期胚胎細(xì)胞中的甲基化狀況,探討它與HBV基因在早期胚胎細(xì)胞中表達(dá)的關(guān)系。
　　【材料與方法】：
　　(1)材料:①重組質(zhì)粒pBR322-HBV;②6-8周齡雌性金黃地鼠;③人精子由HBsAg陰性的志愿者提供;④甲基化試劑盒(Chemicom

3、公司,S7820);(2)方法:①重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù):用pBR322-HBV轉(zhuǎn)染人精子。②用PCR,斑點(diǎn)雜交技術(shù):證實(shí)轉(zhuǎn)染的人精子中含有HBV DNA。③人精子、金黃地鼠去透明帶卵母細(xì)胞異種體外受精及受精后培養(yǎng)技術(shù):獲得早期胚胎細(xì)胞。④甲基化PCR(MSP)檢測(cè)技術(shù):檢測(cè)HBs和HBx基因啟動(dòng)子在精子和早期胚胎細(xì)胞中的甲基化狀況。⑤甲基化測(cè)序 PCR及 BLAST分析技術(shù):精確檢測(cè)HBs基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。⑥RT-PCR技術(shù):檢測(cè)胚胎

4、細(xì)胞中HBs和HBx基因的表達(dá)。
　　【結(jié)果】：
　?、侔唿c(diǎn)雜交結(jié)果顯示,用pBR332-HBV轉(zhuǎn)染的人精子經(jīng)6次洗滌后,洗液中已不再有HBV DNA,排除了由于洗液污染給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來的假陽性的可能。②PCR結(jié)果表明,精子和早期胚胎細(xì)胞基因組中含有 HBV DNA序列。③通過人精子、地鼠去透明帶卵母細(xì)胞異種體外受精及受精后培養(yǎng),獲得了實(shí)驗(yàn)所需的單細(xì)胞胚和2-細(xì)胞胚樣本。④甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)結(jié)果表明,在重組質(zhì)粒p

5、BR332-HBV中,HBs和HBx基因啟動(dòng)子區(qū)是非甲基化的;而在精子基因組中HBs和HBx基因啟動(dòng)子區(qū)已經(jīng)甲基化了;在單細(xì)胞胚和2-細(xì)胞胚基因組中,HBs和HBx基因啟動(dòng)子區(qū)呈去甲基化狀態(tài)。⑤甲基化測(cè)序 PCR(BSP)及 BLAST分析表明,在精子基因組樣本中可擴(kuò)增出 HBs基因啟動(dòng)子區(qū)112 bp的陽性條帶,條帶區(qū)域的所有 CpG位點(diǎn)呈甲基化狀態(tài)。⑥RT-PCR結(jié)果表明,由精子帶入受精卵的HBs和HBx基因能夠在早期胚胎細(xì)胞中表達(dá)