抗桔霉素單克隆抗體制備及其在紅曲桔霉素檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、紅曲，泛指紅曲菌(Monascusspp.)在米飯或淀粉基質(zhì)上生長(zhǎng)發(fā)酵的產(chǎn)品。紅曲在我國(guó)的應(yīng)用至今已有一千多年的歷史，是我國(guó)傳統(tǒng)的特色發(fā)酵食品，主要生產(chǎn)地在福建、浙江、臺(tái)灣等省，被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵劑、食用色素、食品防腐劑、食品增香劑及中藥的生產(chǎn)。然而自1995年，法國(guó)Blanc教授證實(shí)紅曲中桔霉素的存在，使紅曲的安全性受到質(zhì)疑。目前桔霉素的檢測(cè)方法主要是儀器檢測(cè)方法，存在檢測(cè)成本高、時(shí)間長(zhǎng)和難于推廣等缺點(diǎn)，因此，迫切需要建立一種經(jīng)濟(jì)、

2、簡(jiǎn)便和快速的檢測(cè)方法。 本文采用活性酯法將桔霉素與載體蛋白連接，獲得了桔霉素的完全抗原，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，制備了抗桔霉素的單克隆抗體，建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，并分析了紅曲中桔霉素含量。具體內(nèi)容如下。 1、桔霉素人工抗原的構(gòu)建 桔霉素(citrinin，CIT)分子量為250.3，屬于只有反應(yīng)原性而無(wú)免疫原性的半抗原(hapten)，必須與蛋白質(zhì)等載體結(jié)合構(gòu)建成完全抗原才能刺激動(dòng)物產(chǎn)生抗體。根據(jù)桔霉素具備活潑羧

3、基基團(tuán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用活性酯法分別與牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)和卵清蛋白(ovalbumin，OVA)偶聯(lián)制備得到免疫抗原CIT-BSA和包被抗原CIT-OVA，偶聯(lián)比分別為8.4:1和6.3:1。并采用紫外和紅外光譜法對(duì)偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行了分析。 2、抗桔霉素單克隆抗體的制備及其ELISA的建立 以CIT-BSA免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，融合率約為61.

4、3％。采用有限稀釋法，從陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株中篩選得到兩株能穩(wěn)定分泌高特異性、高靈敏度的抗CIT單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為5H1和787。 以上述制備的抗原和抗體為材料，通過(guò)對(duì)包被條件、抗原抗體反應(yīng)條件等研究，優(yōu)化得到了CIT的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA條件為：CIT-OVA用0.05mol/mLpH9.6的碳酸鹽緩沖液在4℃包被12h，包被濃度為2μg/mL，5H1和787所產(chǎn)腹水抗體用緩沖液(含0.05％(v/v)Tween-

5、20的0.01mol/LpH7.4的磷酸緩沖溶液生理鹽水，PBST)分別稀釋為1:2000和1:1000，競(jìng)爭(zhēng)抗原與抗體混勻37℃加入酶標(biāo)板中反應(yīng)1h，然后加入酶標(biāo)二抗(以PBST作1:4000稀釋)37℃反應(yīng)1h，加底物37℃反應(yīng)10min，用2mol/LH2SO4終止反應(yīng)，測(cè)定OD492m值。 根據(jù)上述優(yōu)化的ELISA條件，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，以競(jìng)爭(zhēng)抗原CIT的濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，競(jìng)爭(zhēng)抑制率為縱坐標(biāo)，作圖得到CIT對(duì)5H1

6、和7B7抗體的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，CIT的檢測(cè)靈敏度分別為24.95ng/mL和33.78ng/mL，線性方程分別y=-7.14x+72.97，(R2=0.962)，y=-7.83x+77.56，(R2=0.982)，線性范圍均為2ng/mL～200ng/mL。 同時(shí)，在上述優(yōu)化條件下，研究了5H1和787分泌的抗體對(duì)黃曲霉毒素(B1、B2、G1、G2、M1)和棒曲霉素(patulin)的特異性，結(jié)果表明，本研究所獲得5H1及787分

7、泌的抗體與以上毒素均無(wú)交叉反應(yīng)。說(shuō)明獲得的兩株細(xì)胞分泌抗體的特異性好。 3、紅曲中的桔霉素加標(biāo)回收及ELISA檢測(cè) 在經(jīng)HPLC確證不含CIT的空白紅曲樣品中，分別添加不同濃度CIT，添加量在0.05μg/g～0.5μg/g時(shí)，經(jīng)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析，CIT的平均添加回收率為83.2％～94.4％，變異系數(shù)為6.3％～9.6％。在此基礎(chǔ)上，選取來(lái)源不同的28株紅曲菌制得紅曲米，經(jīng)ELISA檢測(cè)，樣品中桔霉素含量在0.0