食品中桔霉素快速檢測(cè)方法的研究.pdf

1、背景：桔霉素又稱桔青霉素,在紅曲產(chǎn)品中的含量較多,紅曲在我國(guó)應(yīng)用有近千年歷史,很早就廣泛用作食品防腐劑、增香劑、發(fā)酵劑,釀酒以及制備紅曲和各種傳統(tǒng)食品.桔霉素是一種真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,具有較明顯的腎毒性,對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可致畸,劑量過(guò)大會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡.目前,最常用的桔霉素檢測(cè)方法主要為酶聯(lián)免疫吸附分析方法、高效液相色譜法和高效毛細(xì)管電泳法等,上述檢測(cè)方法均需要復(fù)雜的樣品前處理步驟,不僅復(fù)雜,耗時(shí)長(zhǎng),且難以進(jìn)行痕量檢測(cè).采用免疫親和層析方法

2、直接對(duì)樣品中的桔霉素進(jìn)行富集凈化,不僅可同時(shí)制備、萃取和凈化樣品,且免疫親和柱具有較好的特異性,重現(xiàn)性好,能快速?gòu)臉悠分蟹蛛x純化出桔霉素.本研究采用自制的免疫親和柱萃取樣品中的桔霉素,采用具有高效分離能力的高效毛細(xì)管電泳法進(jìn)行分離檢測(cè),建立的快速檢測(cè)方法可用于多種食品中桔霉素的常規(guī)檢測(cè)與監(jiān)管.
　　目的：采用合成桔霉素免疫原免疫動(dòng)物,獲得抗桔霉素抗體.采用本體聚合的方法,優(yōu)化條件制備嵌合銅離子(CuII)聚合物作為免疫親和柱填料,

3、將所得抗體偶聯(lián)于聚合物填料制備免疫親和柱,并對(duì)兩種紅曲產(chǎn)品中的桔霉素進(jìn)行富集凈化,同時(shí)用高效毛細(xì)管電泳的方法進(jìn)行分離檢測(cè),建立了食品中桔霉素的快速檢測(cè)方法.
　　方法：合成桔霉素免疫原,并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,采用合成的免疫原免疫大白兔制備抗桔霉素多克隆抗體.采用間接非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析方法測(cè)定抗血清效價(jià),并進(jìn)一步采用高效毛細(xì)管電泳方法驗(yàn)證抗血清中含有抗桔霉素的特異性抗體.制備嵌合銅離子聚合物填料,以丙烯酰胺作為功能單體,以二甲基丙

4、烯酸乙二醇酯(EGDMA)作為交聯(lián)劑,采用本體聚合的方法合成嵌合銅離子聚合物.利用CuII對(duì)蛋白質(zhì)分子的螯合力,將抗桔霉素多克隆抗體吸附到嵌合銅離子聚合物的固定相上.然后將吸附了抗體的固定相裝入固相萃取柱里制備免疫親和柱,對(duì)洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化.在此條件下,測(cè)定了免疫親和柱吸附容量、添加回收率等性能指標(biāo).最后,用高效毛細(xì)管電泳的方法檢測(cè)樣品中的桔霉素,選擇pH為9.28的20 mmol/L的硼砂緩沖液,運(yùn)行電壓為20 kV,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為

5、319 nm,毛細(xì)管柱溫為25℃.毛細(xì)管的有效長(zhǎng)度為45 cm,毛細(xì)管的內(nèi)徑為75μm,對(duì)其分離分析條件進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化.
　　結(jié)果：對(duì)合成針對(duì)桔霉素抗原中載體蛋白與桔霉素的物質(zhì)的量之比進(jìn)行紫外測(cè)定,桔霉素與BSA物質(zhì)的量之比是26.38:1,桔霉素與OVA的物質(zhì)的量之比是17.58:1.采用桔霉素和BSA的偶聯(lián)物為免疫原免疫大白兔,分析了抗體的產(chǎn)生進(jìn)程與效價(jià).1號(hào)和2號(hào)大白兔分別從第35天和第49天開始有明顯抗體產(chǎn)生,約在第77

6、天抗體含量達(dá)到最高峰,3號(hào)大白兔一直沒(méi)有較明顯的抗體產(chǎn)生.1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)大白兔的抗血清效價(jià)分別是:1:135000、1:16000和1:4000.優(yōu)化選擇了制備嵌合銅離子聚合物的合成條件,在水溶液環(huán)境下,選擇的醋酸銅含量是30 mg,聚合物吸附抗體時(shí)間為10 h,測(cè)得聚合物對(duì)抗體的最大吸附量是196 mg/g,選用pH為7,濃度為60％的甲醇,抗體能夠較好地吸附到CuII聚合物上.采用高效毛細(xì)管電泳方法測(cè)定紅曲產(chǎn)品中的桔霉素,通過(guò)研究

7、洗脫液的種類、濃度和pH等因素對(duì)分離結(jié)果的影響,選用80％的甲醇溶液作為提取劑,采用PBS緩沖液洗滌,60％的甲醇溶液洗脫,可以將免疫親和柱中結(jié)合的桔霉素完全洗脫下來(lái),并且不會(huì)影響CuII聚合物上所連抗體的穩(wěn)定性。測(cè)得免疫親和柱對(duì)桔霉素的最大吸附能力約為597 ng,通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè),在50～150μg/kg濃度范圍內(nèi),紅曲紅和紅曲米中樣品桔霉素回收率為83.7％～93.2％,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.84％～2.06％.
　　結(jié)論：本研究通