展青霉素單克隆抗體的制備及免疫學(xué)檢測(cè)方法的初步應(yīng)用.pdf

1、展青霉素(Patulin，PAT)是由青霉菌、鐮刀菌和曲霉屬真菌污染食物產(chǎn)生的一種霉菌毒素，能產(chǎn)生于水果、谷物、奶酪[1]、腌肉[2]等食物中，在自然界中分布廣泛，尤其存在于腐敗、脫落的山楂、蘋果等水果及水果制品中，能造成遺傳物質(zhì)損傷[3]和破壞腸道粘膜細(xì)胞[4]等毒性。為保障食品安全，建立一種靈敏度高、操作簡便、價(jià)格低廉且能高效進(jìn)行大批量樣品檢測(cè)的展青霉素快速檢測(cè)方法，通過分析PAT分子結(jié)構(gòu)和理化特性，運(yùn)用人工抗原合成技術(shù)和單克隆抗體

2、技術(shù)制備其單抗，并組裝間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫(ELISA)快速檢測(cè)試劑盒及膠體金試紙條。主要研究結(jié)果如下:
　　1展青霉素人工抗原的制備與鑒定
　　利用人工抗原合成技術(shù)，采用羰基咪唑法將作為半抗原的PAT分子與卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)，同時(shí)，采用混合酸酐法，將PAT進(jìn)行分子改造后與載體牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)，分別制備得PAT完全抗原PAT-OVA和PAT-BSA。通過紫外掃描法(UV)、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS

3、-PAGE)和酶聯(lián)免疫方法對(duì)免疫小鼠后獲得的多克隆血清的效價(jià)和敏感性進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)而對(duì)人工抗原進(jìn)行鑒定。紫外掃描圖譜顯示，合成的兩種人工抗原的最大紫外吸收峰均較標(biāo)品和載體發(fā)生明顯的位移;凝膠電泳結(jié)果表明兩種人工抗原比載體蛋白的分子量要相對(duì)較大;利用PAT-BSA免疫小鼠后所獲得的血清對(duì)PAT具有明顯的敏感性，表明展青霉素人工抗原制備成功。
　　2展青霉素單克隆抗體的制備與免疫學(xué)鑒定
　　用人工抗原PAT-BSA免疫Balb/c

4、小鼠3只，篩選出1只血清效價(jià)高、抑制價(jià)好的小鼠成為細(xì)胞融合小鼠，將該小鼠脾細(xì)胞與NS0瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，用HAT培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，以PAT-OVA抗原檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，篩選、克隆出能分泌特異性強(qiáng)、敏感性好的PAT單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞培養(yǎng)上清的效價(jià)為1∶8.0×102，以雜交瘤細(xì)胞對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行腹腔注射，產(chǎn)生腹水效價(jià)為1∶5.12×105的展青霉素單克隆抗體(anti-PAT)。通過間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法進(jìn)行鑒定，

5、該單抗對(duì)PAT的半數(shù)抑制(IC50)為29.69ng/mL。
　　3展青霉素酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)方法的建立
　　依據(jù)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)原理，組裝了間接抑制ELISA檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)山楂中展青霉素的含量。試劑盒的PAT-OVA最適包被濃度為0.4μg/mL、anti-PAT的最適濃度為0.5μg/mL，檢測(cè)范圍為4.14～41.72ng/mL，半數(shù)抑制濃度為13.14ng/mL，檢測(cè)限為2.82ng/mL且PAT檢測(cè)實(shí)驗(yàn)可以在1