RNA干擾逆轉(zhuǎn)白血病細胞耐藥性的研究.pdf

1、耐藥是白血病化療失敗的主要原因。多藥耐藥基因mdr1編碼的跨膜糖蛋白P-gp能將不同結(jié)構(gòu)的化療藥物泵出細胞，導致耐藥，造成白血病難治和復發(fā)。目前臨床逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物鈣通道阻滯劑、環(huán)孢素A、抗生素、酶類抑制劑等從蛋白質(zhì)水平，通過阻斷P-gp的通道作用或降低細胞內(nèi)解毒酶類的活性從而逆轉(zhuǎn)耐藥，這些藥物的有效逆轉(zhuǎn)耐藥劑量通常遠遠超出其毒性最小劑量,應用時的毒副作用嚴重，限制臨床使用。新藥物的尋找和開發(fā)迫在眉睫。 RNA干擾是使轉(zhuǎn)錄后基因沉

2、默的有力武器，是廣泛存在于機體的內(nèi)源的、自然的途徑，因其能高效特異催化切割靶mRNA，使轉(zhuǎn)錄后基因表達下調(diào)，成為腫瘤和病毒性疾病基因治療藥物開發(fā)熱點。研究證明，RNA干擾較其它反義技術(shù)能更好的下調(diào)胞漿mRNA表達，而且RNAi可以通過構(gòu)建表達載體，長期沉默靶基因，并通過特異性啟動子來調(diào)控其在不同組織的表達。 另外，研究耐藥的逆轉(zhuǎn)，尚需尋找合理的研究對象。目前對腫瘤耐藥的體外研究所用的細胞株多為藥物持續(xù)誘導產(chǎn)生，耐藥性狀不穩(wěn)定，在

3、基因治療逆轉(zhuǎn)耐藥的研究中不能精確反應逆轉(zhuǎn)因素的作用。 基于以上研究現(xiàn)狀，本文針對三條mdr1mRNA靶序列構(gòu)建了四條抗mdr1RNA干擾真核表達載體，以期逆轉(zhuǎn)mdr1所致耐藥；將mdr1全長cDNA轉(zhuǎn)染入K562細胞構(gòu)建單基因因素耐藥細胞模型。 方法：針對三條mdr1的靶序列設計構(gòu)建了四條shRNA真核表達載體，脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染入對化療耐藥的K562/A02細胞。48小時后，收獲細胞進行檢測。 將含有mdr1全長c

4、DNA的真核表達載體，脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染入對化療藥物敏感的K562細胞，G418篩選抗性克隆。 mdr1基因表達的檢測從以下四個層面進行：mRNA水平，用RT-PCR及實時熒光定量PCR檢測mRNA表達；蛋白表達水平，流式細胞術(shù)檢測細胞膜P-gp表達；蛋白功能水平，Rh123或柔紅霉素泵出試驗檢測P-gp外排泵功能；細胞功能水平，MTT檢測細胞對藥物耐受性。 結(jié)果：1.設計構(gòu)建了三條針對mdr1基因的shRNA真核表達載體P

5、mdr1sh1、Pmdr1sh2、Pmdr1sh3，因為合成失誤，意外得到一條在轉(zhuǎn)錄的正義鏈少一個堿基的shRNA載體Pmdr1sh2W。 2.①針對mdr1三條靶序列的shRNA均能顯著下調(diào)mRNA的表達，定量PCR測得mdr1的表達分別為：Pmdr1sh1(0.08±0.02)，Pmdr1sh2(0.07±0.01)，Pmdr1sh2W(0.07±0.03)，Pmdr1sh3(0.10±0.01)，實驗組間比較差異無顯著性，

6、而兩組對照細胞mdr1表達分別為Phk(0.57±0.12)，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Blank組(0.78±0.21)，與RNA干擾各組比較差異有顯著性；以Phk為對照，Pmdr1sh1，Pmdr1sh2，Pmdr1sh2W,Pmdr1sh3分別下調(diào)mdr1mRNA表達為，86％，88％，88％，82％。②柔紅霉素泵出實驗顯示轉(zhuǎn)染抗mdr1shRNA的細胞膜泵功能明顯下降，60min時，柔紅泵出率分別為Pmdr1sh1(13％)，Pmdr1sh2(

7、6％)，Pmdr1sh2W(10％).Pmdr1sh3(22％)，Phk(45％)，Blank(40％)；90分鐘時，熒光顯微鏡下Phk和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組兩組對照細胞內(nèi)均未見柔紅霉素所發(fā)熒光，而RNA干擾各組均可見較強熒光。③MTT實驗也提示轉(zhuǎn)染抗mdr1shRNA的四組細胞對阿霉素的耐藥性明顯下調(diào)，各組細胞RI分別為Pmdr1sh1(2.39)，Pmdr1sh2(1.91)，Pmdr1sh2W(2.19)，Pmdr1sk3(3.07)，P

8、hk(8.92)，Blank(9.90)。④Pmdr1sh2W在轉(zhuǎn)錄的正義鏈少合成一個G，沒有影響其功能，與正確序列的Pmdr1sh2相比，同樣能有效下調(diào)mRNA表達，無統(tǒng)計學差異。 3.通過基因轉(zhuǎn)染的方法成功構(gòu)建耐藥細胞模型K562/mdr1。①RT-PCR提示其有mdr1轉(zhuǎn)錄，但較耐藥細胞株K562/A02稍弱；Q-PCR進一步證實K562/mdr1的mdr1表達(0.09±0.01)明顯高于K562/neo(0.00046

9、±0.000006)，低于K562/A02(0.21±0.02)，差異有顯著性。②流式細胞術(shù)檢測細胞膜表面P-gp蛋白，K562/mdr1細胞有P-gp表達，平均熒光強度(FI4.41)，明顯高于K562(FI0.32)，但弱于耐藥細胞系K562/A02的表達(FI6.18)。③Rh123泵出實驗檢測P-gp功能提示K562/mdr1外排藥物的能力明顯強于K562/neo組，與K562/A02相似，90min時，Rh123的泵出率為，K

10、562/mdr1(60％)，K562/neo(6％)，K562/A02(57％)。④MTT檢測K562/mdr1對阿霉素耐受性亦明顯高于K562/neo組，但低于K562/A02組，RI為K562/mdr1(6.5)，K562/neo(1)，K562/A02(10.1)，差異有顯著性。 結(jié)論：1.針對mdr1三條靶序列的shRNA均能有效下調(diào)其mRNA表達，不同靶點沒有統(tǒng)計學差異。 2.在shRNA轉(zhuǎn)錄的正義鏈少合成一個