RNA干擾技術(shù)逆轉(zhuǎn)白血病K562-ADM細(xì)胞的耐藥性及其機(jī)制研究.pdf

1、目的： 研究小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)對(duì)白血病K562/ADM多藥耐藥細(xì)胞mdr1基因及其表達(dá)產(chǎn)物P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的表達(dá)和功能的影響以及耐藥性的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)，探討siRNA逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞多藥耐藥性的可能機(jī)制。 方法： 選擇K562/ADM細(xì)胞作為研究靶細(xì)胞，針對(duì)mdr1基因mRNA不同靶點(diǎn)設(shè)計(jì)合成4對(duì)含有21個(gè)堿基的siRNA(si-md

2、r1/333、si-mdr1/764、si-mdr1/1074和si-mdr1/2832)及陰性對(duì)照siRNA分子，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染K562/ADM細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和RT-PCR檢測(cè)mdr1基因mRNA的表達(dá)：流式細(xì)胞儀(FCM)測(cè)定P-gP蛋白表達(dá)水平及功能、線粒體膜電位(△Ψm)和Caspase-3活性；RT-PCR檢測(cè)caspase-3和caspase-9基因mRNA的表達(dá)；Annexin V/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)K562/AD

3、M細(xì)胞凋亡，MTT比色法檢測(cè)K562/ADM細(xì)胞對(duì)阿霉素(ADM)、柔紅霉素(DNR)和足葉乙甙(Vp16)的敏感性。 結(jié)果： 篩選針對(duì)mdr1 mRNA的4個(gè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)合成的siRNAS分子，其中針對(duì)333靶點(diǎn)的siRNA(si-mdrl/333)對(duì)mdr1基因的表達(dá)具有較好的沉默效果，RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，mdr1 mRNA表達(dá)分別降低69﹪和63﹪；P-gP合成明顯降低，72h時(shí)P-gP表達(dá)陽(yáng)性率降低

4、，由95.6﹪降低至62.3﹪，平均熒光強(qiáng)度(MFI)由2.52降低至1.99，同時(shí)P-gp的外排功能受抑，細(xì)胞ADM含量顯著增高，陽(yáng)性率由50.6﹪升高至93.6﹪。經(jīng)si-mdr1/333(200nmol/L)作用48h，RT-PCR和FCM檢測(cè)證實(shí)caspase-3和caspase-9基因mRNA的表達(dá)均無(wú)明顯變化，但Caspase-3活性顯著增強(qiáng)，活化Caspase-3由對(duì)照的0.84﹪增高至14.5﹪。K562/ADM細(xì)胞經(jīng)2

5、00nmol/Lsi-mdr1/333作用48h后線粒體跨膜電位(△Ψm)無(wú)明顯變化。si-mdr1/333可顯著提高K562/ADM細(xì)胞對(duì)ADM、DNR和Vp16的敏感性，耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為3.45、1.70和2.91倍。Annexin V/PI雙染色顯示si-mdr1/333處理后，經(jīng)低濃度Vp16(40μmol/L)誘導(dǎo)24h，K562/ADM凋亡細(xì)胞明顯增高，細(xì)胞凋亡率由2.32﹪(對(duì)照)增高至14.42﹪(siRNA+Vp16