大黃素甲醚逆轉白血病耐藥細胞系K562-ADM耐藥性的研究.pdf

1、目的：
　　本文旨在評價大黃素甲醚對慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)耐藥細胞系K562/ADM多藥耐藥的逆轉作用及其機制。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng)：采用腫瘤細胞體外培養(yǎng)技術培養(yǎng)CML細胞系K562細胞與耐藥細胞系K562/ADM細胞。
　　2.CCK8（cell counting kit-8，CCK8）：檢測①K562細胞與K562/ADM細胞之間的耐藥倍

2、數;②不同濃度的大黃素甲醚藥物干預后K562/ADM細胞的細胞活性;③微小RNA146a（microRNA146a，miR-146a）抑制劑(miR-146a inhibitor)及靶向CXCR4siRNA分別下調K562細胞中miR-146a及CXCR4的表達后，在阿霉素(adriamycin，ADM)的干預下K562細胞的活性;④大黃素甲醚聯合ADM對K562/ADM細胞活性的影響。
　　3.細胞克隆形成實驗：檢測大黃素甲醚聯

3、合ADM對K562/ADM細胞活性的影響。
　　4.流式細胞術及Hoechst33258檢測細胞凋亡：檢測①miR-146ainhibitor干預K562細胞后，檢測K562細胞組、K562+NC組及K562+miR-146a inhibitor組中細胞的凋亡情況;②miR-146a mimic干預K562/ADM細胞后，檢測K562/ADM細胞組、K562/ADM+NC細胞組及K562/ADM+miR-146a mimic細胞組

4、中細胞的凋亡情況;③miR-146a及趨化因子受體-4(chemokine receptor-4，CXCR4)對K562細胞凋亡的影響;④大黃素甲醚聯合ADM對K562/ADM細胞凋亡的影響;⑤降低K562/ADM細胞中miR-146a的表達后大黃素甲醚對阿霉素誘導的細胞凋亡的影響。
　　5.實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)：檢測①K562細胞與K562/ADM細胞miR-

5、146a的表達;②轉染miR-146a抑制劑下調K562細胞中的miR-146a的表達后各組K562細胞中miR-146a的表達情況;③K562/ADM細胞轉染miR-146a mimic過表達miR-146a后，各組K562/ADM細胞中miR-146a的表達情況;④下調K562細胞中的miR-146a表達后，各組K562細胞中P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gP)、多藥耐藥蛋白-1（multidrug resistan

6、t related protein，MRP-1）、CXCR4的表達情況;⑤上調K562/ADM細胞中的miR-146a的表達后，各組K562/ADM細胞中p-gP、MRP-1、CXCR4的表達情況;⑥大黃素甲醚干預下K562/ADM細胞中miR-146a的表達情況;⑦K562細胞中轉染CXCR4靶向siRNA、miR-146a抑制劑及轉染CXCR4靶向siRNA+miR-146a抑制劑后，各組細胞中CXCR4的表達情況;⑧不同濃度的大黃

7、素甲醚對K562/ADM細胞中CXCR4表達的影響。
　　6.蛋白免疫印跡：檢測①下調K562細胞中的miR-146a表達后，各組K562細胞中CXCR4的蛋白表達情況;②上調K562/ADM細胞中的miR-146a的表達后，各組K562/ADM細胞中CXCR4的蛋白表達情況;③不同濃度的大黃素甲醚干預K562/ADM細胞后，各紹細胞中CXCR4的蛋白表達情況;④K562細胞中轉染CXCR4靶向siRNA、miR-146a抑制劑及

8、轉染CXCR4靶向siRNA+miR-146a抑制劑后，各組細胞中CXCR4蛋白的表達情況。
　　7.遷移實驗：評估K562/ADM細胞中大黃素甲醚對CXCR12結合到CXCR4的影響。
　　8.細胞表面的CXCR4：檢測①下調K562細胞中的miR-146a表達后，各組K562細胞表面CXCR4的表達情況;②上調K562/ADM細胞中的miR-146a的表達后，各組K562/ADM細胞表面CXCR4的表達情況。
　　

9、結果：
　　1、miRNA-146a在K562/ADM細胞中的表達降低
　　K562細胞和K562/ADM細胞經ADM干預48小時后的IC50分別為0.15μM和3.5μM，表明K562/ADM的耐藥倍數是K562細胞的23倍;與K562細胞相比，K562/ADM中miR-146a的表達明顯較低。
　　2、下調miR-146a能增強K562細胞對ADM的耐藥性
　　轉染miR-146a抑制劑后miR-146a的表

10、達水平明顯降低;下調miR-146a后的K562細胞的生存率明顯高于正常的K562細胞及陰性對照組（IC50分別為2.8μM，0.15μM，和0.18μM。下調miR-146a能明顯增強K562細胞抵抗ADM誘導的凋亡。
　　3、上調miR-146a能使K562/ADM細胞對ADM的促凋亡更敏感
　　轉染miR-146a mimic的K562/ADM細胞中的miR-146a表達明顯增高，與K562/ADM細胞及轉染空白質粒的

11、K562/ADM細胞相比能明顯增強K562/ADM細胞對ADM的敏感性（IC50分別為0.42μM，3.5μM及3.2μM），表明，上調miRNA-146a能使K562/ADM細胞對ADM誘導凋亡的作用更敏感。
　　4、miRNA-146a主要針對CXCR4參與K562細胞對ADM耐藥性
　　下調K562細胞中的miR-146a或者上調K562/ADM中的miR-146a未能引起P-gp及MRP-1的mRNA明顯改變，而且m

12、iR-146a的表達與CXCR4mRNA的表達呈負相關CXCR4是miR-146a的直接目標。靶向CXCR4siRNA能抑制細胞中CXCR4的表達;miR-146a抑制劑能誘導CXCR4表達的上調并且能明顯地增強K562細胞的耐藥性。
　　5、大黃素甲醚能增強K562/ADM細胞對ADM的敏感性
　　大黃素甲醚對K562/ADM細胞活性的影響呈劑量依賴性;耐藥逆轉倍數在2μM和5μM的濃度下分別為2.03倍和5.3倍。與單獨

13、用ADM干預的細胞相比，當大黃素甲醚和ADM聯合作用于K562/ADM時，細胞集落數及集落大小明顯減少。與單獨用ADM干預相比，聯合干預濃度在2μM和5μM大黃素甲醚作用于細胞后能顯著增加K562/ADM細胞的凋亡。
　　6、大黃素甲醚通過上調miR-146a和干預CXCL12/CXCR4信號通路逆轉耐藥
　　大黃素甲醚干預細胞后能導致K562/ADM細胞中miR-146a水平呈劑量依賴性增加。大黃素甲醚增強K562/ADM