柑橘褐斑病和黑腐病病原及內(nèi)生型鏈孢菌的比較研究.pdf

1、鏈格孢屬(Alternaria)真菌包括腐生菌、內(nèi)生菌和致病菌，可引起柑橘上4種病害，即柑橘褐斑病(Alternaria brown spot)，粗檸檬葉斑病(Alternaria leaf spot ofrough lemon)，柑橘黑腐病(Alternaria black rot)和墨西哥萊蒙葉片斑點(diǎn)病(manchafoliar of citrus)。本研究收集我國(guó)柑橘主產(chǎn)區(qū)黑腐病、褐斑病病原、內(nèi)生型鏈格孢及癥狀不明菌株共81株，選

2、擇代表菌株從形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性、交互致病性、ACT合成基因存在與否檢測(cè)，及基于內(nèi)源多聚半乳糖醛酸酶基因(endoPG)和兩個(gè)無名基因的DNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化，分析不同癥狀來源菌株間的差異，確定不同病害病原的種屬關(guān)系。結(jié)果如下:
　　以2個(gè)黑腐病菌株，5個(gè)褐斑病菌株及2個(gè)內(nèi)生型鏈格孢菌株為代表，在PCA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，產(chǎn)孢后逐一觀察和測(cè)定各個(gè)菌株分生孢子的形態(tài)、大小、分隔類型和分隔數(shù)、分生孢子梗特征、分生孢子鏈長(zhǎng)度和鏈的分支數(shù)等，發(fā)現(xiàn)相

3、同癥狀來源菌株間的形態(tài)學(xué)變異較大，無法找到相關(guān)參數(shù)（指標(biāo)）將這些菌株根據(jù)病害癥狀劃分分類單元。
　　黑腐病菌株ZJMJR25、褐斑病菌株ZJOGS2和內(nèi)生型菌株FJGMW7在PDA、PCA和V8培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果顯示同一培養(yǎng)基條件下，菌株間的菌絲生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量無明顯差異，但對(duì)碳源和氮源利用差異較大。因菌株數(shù)量有限，暫無法確定該差異與病害具有相關(guān)性。
　　致病性測(cè)定結(jié)果顯示，100μl濃度為105個(gè)·ml-1的孢子懸浮液涂抹

4、椪柑和甌柑幼葉接種，所有褐斑病菌株均可引起典型的褐斑病癥狀，病情等級(jí)多達(dá)4-5級(jí)。部分黑腐病菌株能引起椪柑(4/39)或甌柑(8/39)幼葉輕微發(fā)病，內(nèi)生型菌株中部分也可對(duì)椪柑(12/20)或甌柑(4/20)葉片致病，病情等級(jí)多在3級(jí)以下，病斑黑色，無明顯黃色暈圈。相反，200μl相同濃度孢子液注射果實(shí)接種，所有菌株均可引起黑腐病。選用引物對(duì)ACTT1R2/ACTT1F2和ACTT2R1/ACTT2R1擴(kuò)增ACT毒素編碼基因ACTT1和

5、ACTT2，所有褐斑病菌株都能分別擴(kuò)增出約785bp和840bp的目標(biāo)片段，黑腐病病原和內(nèi)生型鏈格孢菌則不能，說明后兩者不存在ACT毒素合成基因。
　　選用本研究中的75個(gè)國(guó)內(nèi)鏈格孢菌株和國(guó)外已報(bào)道的24個(gè)鏈格孢菌株，以多聚半乳糖醛酸酶基因（endo PG）部分序列、非編碼區(qū)隨機(jī)片段OPA1-3和OPA2-1為標(biāo)記基因分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，所有菌株分為6個(gè)亞分支，但共屬于4個(gè)大類群，中國(guó)菌株只存在于“Clade1，3，4”

6、3個(gè)類群中，而“Clade2”中不包括本實(shí)驗(yàn)中國(guó)內(nèi)的菌株，為美國(guó)所特有。合并3個(gè)基因序列后構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹與單基因構(gòu)樹顯示的各類群在菌株構(gòu)成上有一定的重合性，但不完全相同。所構(gòu)建的3棵進(jìn)化樹均表明，3種癥狀類型鏈格孢菌的群體遺傳變異與菌株致病性分化、地理來源、寄主種類和癥狀類型相關(guān)性不顯著。因此我們認(rèn)為，包括柑橘黑腐病、褐斑病病原菌及內(nèi)生型鏈格孢菌在內(nèi)的中國(guó)柑橘上小孢子種的鏈格孢菌可能同屬一個(gè)復(fù)合種，黑腐病和褐斑病菌間的差異表現(xiàn)在寄主范