紫花苜蓿褐斑病抗性基因分子標記研究.pdf

1、本研究對前人篩選的分子標記的準確性和通用性進行了鑒定并建立一套快速準確對苜蓿褐斑病抗性鑒定和遺傳資源篩選的技術(shù)體系,提高抗病檢測效率,為抗病基因的克隆和遺傳圖譜的建立提供了可靠性高的標記位點,為苜?？购职卟擞涊o助選擇育種以及抗褐斑病基因的定位、克隆奠定基礎(chǔ),對苜?？购职卟》N質(zhì)資源的高效篩選利用和苜?？共∮N研究有重要意義。本項研究得到的主要結(jié)果如下:
　　 選取4個具有不同遺傳背景的紫花苜蓿品種為研究材料,先通過人工接種試驗,

2、根據(jù)病情指數(shù)和抗病性分級標準得出,4個品種的抗病性依次為:賽迪>新疆大葉>中苜一號>龍牧801,賽迪屬于高抗品種,新疆大葉、中苜一號和龍牧801屬于中抗品種,龍牧801的抗病性最低。在4個品種中各篩選出高抗單株10株,病情指數(shù)的平均值在2.11-2.29之間,高感單株10株,病情指數(shù)的平均值在63.75-75.77之間。4個品種的總體病情指數(shù)和抗病性成反比,篩選到的高抗、高感單株的抗病性與4個品種的總體抗病性基本相符。
　　 運

3、用ISSR、AFLP和SRAP分子標記技術(shù)對標記適用性進行驗證。結(jié)果表明:適用性高的標記有感病標記ISSR22S450、抗病標記SRAPM3E3R169和ISSR20R750,分子標記檢測的符合率在75～85％之間,可用于苜蓿褐斑病的標記輔助選擇育種工作。適用性中等的標記有感病標記ISSR6S640和AFLP38S264,抗病標記AFLP1R206、AFLP16R185和ISSR834R450均在1個品種中顯示出差異不顯著,仍需在更多品

4、種中驗證；適用性差的標記有感病標記ISSR11S750和ISSR22S640,不能作為檢測苜蓿褐斑病的可靠指標。本研究結(jié)果不僅為將上述標記轉(zhuǎn)化為SCAR標記奠定了基礎(chǔ),而且為抗病基因的克隆和遺傳圖譜的建立提供了可靠性高的標記位點。
　　 建立抗、感DNA池,通過優(yōu)化紫花苜蓿(Medicago sativa.L)SCAR-PCR主要參數(shù),建立紫花苜蓿SCAR反應(yīng)體系與擴增程序。20μL的反應(yīng)體系中各反應(yīng)物的含量為:10×PCRBu

5、ffer(Mg+Plus15mM)2μL,dNTP(TaKaRa,2.5μM)0.2μM,正／反Primer(Sangon,1μM)0.25μM,模板DNA(10n／μL)20ng,Taq酶(TaKaRa,5U／μL)0.8U,ddH2O9.24μL。采用梯度PCR確定退火溫度,共設(shè)計7個退火溫度:48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃。擴增程序為:94℃,5min；94℃,30sec;退火溫度30sec:72℃,1mi

6、n；36個循環(huán);72℃,10min。
　　 在通用性高和中等的與苜蓿褐斑病連鎖的標記的基礎(chǔ)上,設(shè)計了53對SCAR引物,其中ALSR834S-4、ALSR20-1、ALSS22A-1、ALSS22A-2、AFLP-M1P1-7、AFLP-M2P8-8、AFLP-M5P6-2共7個SCAR標記轉(zhuǎn)化成功,占13.21％。
　　 設(shè)計的3個SCAR-SRAP標記在抗、感單株間均擴出條帶,多態(tài)性消失。將3個標記的抗、感單株的PC