殺蚜蟬擬青霉菌株篩選、培養(yǎng)及其致病作用研究.pdf

1、本文以蚜蟲為試蟲，從不同來源的蟬擬青霉菌株中篩選出對(duì)中藥材板藍(lán)根蚜蟲(Lipaphis erysimi)具有較高致病性的LB菌株，并系統(tǒng)研究其對(duì)蚜蟲的入侵和致病過程、對(duì)蚜蟲的致病性及其影響因子、生物學(xué)特性、液體及固體培養(yǎng)條件優(yōu)化、粗毒素殺蚜活性及常用化學(xué)農(nóng)藥與該菌的相容性等內(nèi)容。本研究旨在探索適合蟬擬青霉生物學(xué)特性的基本培養(yǎng)方法與技術(shù)，揭示其對(duì)蚜蟲的致病機(jī)理及控制潛能，明確蟬擬青霉對(duì)蚜蟲的相互作用關(guān)系，為蚜蟲綜合治理中有效利用蟬擬青霉提

2、供理論依據(jù)，同時(shí)也為寄主與病原物互作關(guān)系的研究提供新的例證。結(jié)果如下： 1、菌株篩選。以不同昆蟲寄主采集的擬青霉(Paecilomyces)和白僵菌(Beauveria)菌株對(duì)白術(shù)蚜蟲(Macrosiphum sp.)進(jìn)行生物測(cè)定。結(jié)果表明，不同屬種的真菌菌株的致病性存在差異，其中蟬擬青霉的幾個(gè)菌株表現(xiàn)了較強(qiáng)的致病力。進(jìn)一步對(duì)12株蟬擬青霉菌株培養(yǎng)特性及其對(duì)蚜蟲的致病性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明不同菌株的培養(yǎng)特性和致病力存在差異，其中以蟬擬青霉

3、LB菌株的致病力強(qiáng)、培養(yǎng)特性優(yōu)良，對(duì)蚜蟲的校正死亡率為80.97％，致死中時(shí)LT50為4.44d，致死中濃度LC50為0.87×106孢子/mL。 2、致病機(jī)理研究。通過掃描電鏡觀察，蟬擬青霉分生孢子在蚜蟲體表萌發(fā)、形成芽管后可產(chǎn)生附著胞或直接侵入表皮，昆蟲節(jié)間膜等薄弱處也是其侵染的主要部分，隨后菌絲在昆蟲體內(nèi)形成，如濕度足夠高，菌絲穿出體表產(chǎn)孢而再侵染新害蟲。用明膠-瓊脂平板法研究了蟬擬青霉12不同來源菌株的胞外蛋白酶產(chǎn)酶水平與其毒力

4、的關(guān)系。結(jié)果表明，不同菌株的產(chǎn)酶水平存在差異，且產(chǎn)酶水平的高低與其對(duì)蚜蟲的毒力存在顯著性關(guān)系。因此可以認(rèn)為該菌的胞外蛋白酶活力是構(gòu)成毒力的主要因素之一。 3、生物學(xué)特性及其與致病性的關(guān)系。溫度、pH、濕度對(duì)蟬擬青霉生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)具有明顯的影響。蟬擬青霉LB菌株生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的最適溫度是25℃。pH6時(shí)菌落生長(zhǎng)最快，分生孢子產(chǎn)生及萌發(fā)的最適值為pH6～7。光照對(duì)菌落生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)沒有明顯影響，對(duì)產(chǎn)孢量有促進(jìn)作用。孢子萌發(fā)的相對(duì)

5、濕度范圍為RH90％～100％，最適濕度是RH100％。在20～30℃范圍內(nèi)，蟬擬青霉LB菌株對(duì)蚜蟲有致病性，在25℃下毒力最強(qiáng)；不同溫度和不同pn值下培養(yǎng)的蟬擬青霉產(chǎn)孢量有差別，但所獲得的分生孢子在相同條件下對(duì)蚜蟲的毒力沒有差異。在RH90～100％范圍內(nèi)，蟬擬青霉LB菌株對(duì)蚜蟲有致病性，在RH100％時(shí)毒力最強(qiáng)。溫度、濕度對(duì)致病性有重要的影響，在溫度、濕度的互作中，濕度更具有重要作用。 4、液體培養(yǎng)條件優(yōu)化。通過對(duì)不同碳源、氮源、無

6、機(jī)鹽等對(duì)蟬擬青霉菌絲生長(zhǎng)的影響研究，結(jié)果表明：葡糖糖為蟬擬青霉液體培養(yǎng)的最適碳源，蛋白胨為該菌生長(zhǎng)的最適氮源，K2HPO4和MgSO4作為無機(jī)鹽有利于菌絲生長(zhǎng)。經(jīng)正交試驗(yàn)篩選出的培養(yǎng)基為：葡萄糖3％，蛋白胨1.5％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鎂0.2％組合為優(yōu)良的液體培養(yǎng)基。搖瓶發(fā)酵的適宜條件為：培養(yǎng)溫度25～27℃，初始pH6～7，接種量6％，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，500 mL三角瓶最適裝液量為100 mL，發(fā)酵周期為7d。 5、

7、液體發(fā)酵代謝特性。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液中的還原糖含量、氨基氮含量、酸堿度和菌絲生物量均發(fā)生明顯的變化。接種培養(yǎng)48h內(nèi)，菌絲產(chǎn)量增長(zhǎng)較慢；培養(yǎng)48～144h，菌絲生物量增長(zhǎng)幅度最大，接種168h，菌絲生物量達(dá)22.45 g/L。培養(yǎng)液的pH值、糖含量、氮含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，菌絲快速生長(zhǎng)的時(shí)期是糖、氮消耗最大的時(shí)期；192h后培養(yǎng)終止時(shí)，發(fā)酵液中的還原糖還有25％尚未消耗，而氨基氮的含量約為60％；接種72h后營(yíng)養(yǎng)液的pH值

8、降為4.56，因此接種72小時(shí)后，可適當(dāng)增加pH值，以利蟬擬青霉菌絲生長(zhǎng)。 6、固體培養(yǎng)條件優(yōu)化。經(jīng)單因素、一般組合和正交試驗(yàn)篩選，得到其適宜的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉+麥麩+黃豆粉+米糠(6:4:1:1).培養(yǎng)條件篩選結(jié)果表明，該菌株固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)化條件為：接種量6％、料水比1:1.2、初始pH值6～7、培養(yǎng)溫度24℃、發(fā)酵時(shí)間22d、培養(yǎng)基厚度在2cm左右、光照24h/d，添加ZnSO4或BaCl2有利于產(chǎn)孢。在此優(yōu)化條件下固態(tài)發(fā)酵

9、培養(yǎng)，其孢子產(chǎn)量穩(wěn)定在45×108個(gè)/g以上，最高產(chǎn)孢量達(dá)到54.72×108個(gè)/g。 7、粗毒素殺蚜活性。發(fā)酵液對(duì)蚜蟲的致死率達(dá)到81.11％，初步表明蟬擬青霉LB菌株液體培養(yǎng)能產(chǎn)生毒殺蚜蟲的物質(zhì)，而且殺蟲活性較高。蚜蟲對(duì)胞外粗毒素敏感，處理2d后的死亡率高，處理后蚜蟲的死亡率隨處理時(shí)間和濃度的提高而增加。胞內(nèi)粗毒素提取物具有一定的殺蚜蟲活性，但不及胞外粗毒素的效果明顯。 8、化學(xué)農(nóng)藥與蟬擬青霉的相容性及增效性。不同的化學(xué)農(nóng)藥對(duì)蟬擬青