灰葡萄孢中甲基化相關(guān)基因的功能研究.pdf

1、灰霉病是一種由葡萄孢屬真菌引起的重要病害，其中灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的寄主范圍最為廣泛，可侵染200多種植物，每年造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。表觀遺傳在動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，我們通過(guò)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢中存在三個(gè)分別編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、HP1（異染色蛋白1）和H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶的基因BC1G12419、BC1G06432和BC1G11188，分別命名為Bcdim-2，Bchp1和Bcdim-5，

2、對(duì)三個(gè)基因的功能進(jìn)行了初步研究，取得如下結(jié)果:
　　1.Bcdim-2基因開放閱讀框4125bp，含有4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子，編碼1025個(gè)氨基酸，含有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶保守結(jié)構(gòu)域;Bchp1基因開放閱讀框1118bp，含有6個(gè)外顯子，6個(gè)內(nèi)含子，編碼244個(gè)氨基酸，含有HP1典型的兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域:CD(Chromo Domain)和CSD(Chrome Shadow Domain); Bcdim-5基因開放閱讀框1752bp，含有

3、4個(gè)外顯子，3個(gè)內(nèi)含子，編碼357個(gè)氨基酸，含有Pre-SET、SET和Post-SET三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。
　　2.Real-time PCR結(jié)果表明這三個(gè)基因在灰葡萄孢的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、菌核形成和致病階段均有表達(dá)，并且Bcdim-2基因在致病階段表達(dá)下調(diào)，Bchp1基因在菌核形成和致病階段表達(dá)下調(diào)，Bcdim-5基因在三個(gè)階段的表達(dá)水平并無(wú)顯著差異。
　　3.根據(jù)同源重組的原理，分別對(duì)這三個(gè)基因進(jìn)行敲除，獲得了基因的敲除轉(zhuǎn)化子。深

4、入研究發(fā)現(xiàn)，敲除Bcdim-2和Bchp1基因不會(huì)影響灰葡萄孢的菌絲生長(zhǎng)速度、尖端形態(tài)、菌核產(chǎn)生、分生孢子形成及其致病力，但Bcdim-5基因敲除轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)速率減緩25％左右，菌絲尖端形態(tài)不變;菌落表面出現(xiàn)白色菌絲糾集，菌核變小變圓，每皿菌核干重下降;分生孢子產(chǎn)生時(shí)間推遲，分生孢子量變少;在番茄、擬南芥、大豆上的致病力均有所降低。對(duì)Bcdim-5基因進(jìn)行互補(bǔ)可恢復(fù)敲除轉(zhuǎn)化子的菌絲生長(zhǎng)速度、分生孢子和菌核形成能力，但其致病力不能完全恢復(fù)

5、。
　　4.選取灰葡萄孢中的致病相關(guān)基因，檢測(cè)其在Bcdim-5基因缺失突變體和B05.10菌株中的表達(dá)量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在突變體中大部分致病相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，推測(cè)Bcdim-5基因敲除菌株致病力的下降與致病相關(guān)基因的下調(diào)表達(dá)有關(guān)。
　　本研究初步證實(shí)Bcdim-5基因與灰葡萄孢的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、菌核形成和致病過(guò)程相關(guān)，Bcdim-5基因敲除后影響致病相關(guān)基因的表達(dá)，而Bcdim-2和Bchp1基因缺失后不會(huì)影響菌株的正常生長(zhǎng)發(fā)育