灰葡萄孢鈣調(diào)磷酸酶基因β亞基及其啟動(dòng)子的克隆與序列分析.pdf

1、植物病原真菌的生長(zhǎng)、發(fā)育和致病性均受到真菌的細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控。如:Ca2+途徑、cAMP途徑和MAPK途徑。CNB基因通過(guò)去磷酸化作用可對(duì)其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，本論文克隆了CNB基因及其5'上游調(diào)控序列，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、拷貝數(shù)的驗(yàn)證，構(gòu)建了CNB基因正反義表達(dá)載體，為進(jìn)一步明確CNB基因與灰葡萄孢病菌的致病性的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。 本試驗(yàn)根據(jù)CNB基因核苷酸序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以番茄灰霉病菌BC1菌株的c

2、DNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)獲得CNB基因的部分片段，通過(guò)NCBI的同源性分析，在灰葡萄孢EST表達(dá)序列標(biāo)簽庫(kù)中發(fā)現(xiàn)兩條與該片段同源性達(dá)到100％的EST標(biāo)簽，通過(guò)DNAMAN軟件分析，拼接獲得了CNB基因525bp的cDNA開(kāi)放閱讀框(ORF)。然后根據(jù)CNB基因cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以番茄灰霉病菌BC1基因組DNA為模板，擴(kuò)增獲得了該基因810bp的DNA全長(zhǎng)序列。利用DNAMAN軟件對(duì)DNA序列和cDNA序

3、列進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)CNB基因cDNA開(kāi)放閱讀框編碼174個(gè)氨基酸，DNA序列含有3個(gè)大小分別為40bp、120bp和84bp的內(nèi)含子，在內(nèi)含子的邊緣都顯示出典型的內(nèi)含子邊緣特征序列“GT…AG”。 利用NCBI對(duì)CNB蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果表明CNB蛋白含有4個(gè)EF手型Ca2+結(jié)合區(qū)域，相對(duì)分子量為19.7498.KD，等電點(diǎn)為4.28，其中含有32個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸，21個(gè)帶正電荷的氨基酸，不含有半胱氨酰、組氨酸和色氨酸，在進(jìn)行

4、蛋白純化時(shí)應(yīng)該選擇弱陽(yáng)離子介質(zhì)進(jìn)行離子交換色譜。利用Genome walking技術(shù)獲得了CNB基因5'上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，通過(guò)Softberry軟件進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明該序列中具有1個(gè)重要的核轉(zhuǎn)錄因子NF-Kb結(jié)合位點(diǎn)，1個(gè)激活蛋白質(zhì)AP-2結(jié)合位點(diǎn)，以及Sp1、E2F、BKLF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)各1個(gè)，該啟動(dòng)子具有如此多的轉(zhuǎn)錄因子位點(diǎn)，而這些作用元件大多與細(xì)胞增殖有關(guān)，這否與灰霉的強(qiáng)致病性有關(guān)，還需要進(jìn)一步的研究證明的。 以