維甲酸對(duì)成纖維細(xì)胞及脂肪源干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)的影響.pdf

1、骨組織的損傷與修復(fù)一直是臨床課題研究的難點(diǎn)與熱點(diǎn)。對(duì)于骨組織的再生不足的問題，研究者一直期望能夠找到適宜的條件或理想的種子細(xì)胞來促進(jìn)骨的再生與修復(fù)。2003年原林教授提出的“筋膜學(xué)”認(rèn)為人體是由尚未分化的非特異性結(jié)締組織（筋膜）支架所構(gòu)成的“支持與儲(chǔ)備系統(tǒng)”和以已分化功能細(xì)胞為基礎(chǔ)的“功能系統(tǒng)”共同構(gòu)成。支持與儲(chǔ)備系統(tǒng)不斷的為功能系統(tǒng)的更新和功能活動(dòng)提供源源不斷的營養(yǎng)物質(zhì)，功能系統(tǒng)在支持與儲(chǔ)備系統(tǒng)支持下維持結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定。功能系統(tǒng)的功

2、能發(fā)揮要基于已經(jīng)特化了的功能細(xì)胞的基礎(chǔ)之上，而支持與儲(chǔ)備系統(tǒng)的筋膜支架是以干細(xì)胞為核心，通過分化出各種定向干細(xì)胞，為功能系統(tǒng)的更新提供源源不斷的細(xì)胞補(bǔ)充，并為功能系統(tǒng)的各種細(xì)胞的更新、代謝提供一個(gè)穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境。受損組織器官的修復(fù)過程實(shí)際是支持儲(chǔ)備系統(tǒng)中未完全分化的細(xì)胞向該組織器官內(nèi)原有細(xì)胞定向分化的補(bǔ)充的過程，并且為功能系統(tǒng)中細(xì)胞的新陳代謝提供營養(yǎng)物質(zhì)，維持其內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。
　　 間充質(zhì)細(xì)胞的多組織來源與筋膜結(jié)締組織支架的全身

3、分布是一致的，其縱向、橫向分化的生物學(xué)特性與筋膜學(xué)提出的筋膜結(jié)締組織對(duì)機(jī)體的支持儲(chǔ)備作用也是一致的。真皮層的成纖維細(xì)胞(DFB)及脂肪源干細(xì)胞(ADSCs)都是來源于中胚層的間充質(zhì)細(xì)胞，二者在生物學(xué)特性及形態(tài)上有相似性，且二者都具有一定的定向分化能力。ADSCs是筋膜中未分化干細(xì)胞的一種儲(chǔ)備形式，具有多分化潛能，能夠跨胚層分化。DFB具有產(chǎn)生纖維（膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維）與有機(jī)質(zhì)的功能，尤其在組織修復(fù)過程中其分泌功能更加明顯。AD

4、SCs具有低免疫原性，免疫調(diào)節(jié)功能和分泌細(xì)胞因子等能力為異體移植提供了有利條件，使脂肪源干細(xì)胞成為生物治療的亮點(diǎn)之一。
　　 人體參與組織損傷與修復(fù)的細(xì)胞主要是成纖維細(xì)胞與未分化的間充質(zhì)細(xì)胞。骨的損傷修復(fù)過程大致可分為血腫的機(jī)化，骨痂的形成與塑性三個(gè)過程。有研究表明在血腫機(jī)化過程中，成纖維細(xì)胞也參與了成骨分化的過程。如何能夠最大限度發(fā)揮成纖維細(xì)胞的成骨分化潛能一直是研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。ADSCs由Zuk等人首次發(fā)現(xiàn)并提取培養(yǎng)。與其

5、他成體干細(xì)胞比較，ADSCs具有來源廣泛、取材方便，創(chuàng)傷小且不存在免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。這類細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能，在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下能向成脂肪、成軟骨、成骨、成肌、成神經(jīng)及心肌等定向分化。
　　 傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)液成分(DMEM+10％FB S+1％雙抗+1％β甘油酸磷酸鈉+0.1％地塞米松+0.5％維生素C)已被證實(shí)對(duì)成纖維細(xì)胞及脂肪源干細(xì)胞有一定的成骨誘導(dǎo)分化功能，但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步探索和研究。維甲酸(RA)是

6、體內(nèi)維生素A的代謝中間產(chǎn)物，有研究表明其對(duì)間充質(zhì)細(xì)胞的成骨過程有著重要的調(diào)節(jié)作用。對(duì)維甲酸作為成骨誘導(dǎo)因素的研究發(fā)現(xiàn)，維甲酸可以促進(jìn)胎鼠顱骨閉合和牙齒的生長。國內(nèi)也有研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的維甲酸可以成纖維細(xì)胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)的沉積。傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)液成分與維甲酸二者對(duì)間充質(zhì)細(xì)胞的成骨分化誘導(dǎo)效果與機(jī)制是否完全相同，這對(duì)于間充質(zhì)細(xì)胞作為骨組織工程種子細(xì)胞具有重要的意義。
　　 目的：
　　 通過RA與傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)液對(duì)DFB與ADSCs兩類

7、間充質(zhì)細(xì)胞成骨誘導(dǎo)的對(duì)比，進(jìn)一步了解不同種類間充質(zhì)細(xì)胞在成骨方面的差異，從而為筋膜學(xué)提供更多的理論依據(jù)，并對(duì)骨組織工程在骨的再生與修復(fù)方面提供更多實(shí)踐支持。
　　 1、分離并離體培養(yǎng)大鼠ADSCs并對(duì)其細(xì)胞表面標(biāo)記物及多向分化潛能進(jìn)行鑒定;
　　 2、分離并離體培養(yǎng)大鼠皮膚DFB并對(duì)其進(jìn)行波形蛋白鑒定;
　　 3、分別使用RA與傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)液對(duì)兩類細(xì)胞進(jìn)行為期2周的成骨誘導(dǎo)，檢測(cè)各項(xiàng)細(xì)胞生長指標(biāo)，如細(xì)胞生長曲線，

8、骨堿性磷酸酶活性，茜素紅染色，RT-PCR檢測(cè)骨鈣素的表達(dá)，分析差異。
　　 方法：
　　 1、取5-7d齡的SD乳鼠背部皮膚，酶消化法分離、培養(yǎng)DFB。通過形態(tài)學(xué)、免疫組化等手段來鑒定其是否為成纖維細(xì)胞。
　　 2取同只乳鼠的腹股溝脂肪墊，酶消化法分離培養(yǎng)ADSCs。通過形態(tài)學(xué)，流式細(xì)胞學(xué)及多向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)鑒定其是否為ADSCs。
　　 3、待細(xì)胞分別培養(yǎng)并傳至第3代，用0.25％胰酶消化下來，用完全培

9、養(yǎng)基重懸，并調(diào)整密度為5×104/ml接種于六孔板內(nèi)。分別用傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)液與RA誘導(dǎo)2周，每孔2ml細(xì)胞懸液。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，RA對(duì)DFB及對(duì)ADSCs誘導(dǎo)影響最大的濃度為10-5mol/L。本實(shí)驗(yàn)共分為6組:DFB空白族，DFB傳統(tǒng)組，DFB維甲酸組，ADSCs空白組，ADSCs傳統(tǒng)組，ADSCs維甲酸組。
　　 4、在誘導(dǎo)過程中選取0d、3d、7d、14d、4個(gè)時(shí)間點(diǎn)繪制各組細(xì)胞生長曲線。
　　 2周后對(duì)

10、各組細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色，骨堿性磷酸酶活性的測(cè)定，RT-PCR檢測(cè)骨鈣素的表達(dá)情況。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，分析對(duì)比差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、原代DFB接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)48h內(nèi)逐漸貼壁，開始細(xì)胞數(shù)量較少，生長緩慢，3d后細(xì)胞換液。5-7d后細(xì)胞大量生長，鏡下細(xì)胞呈梭形或者多角形，排列緊密，呈旋渦狀。將細(xì)胞傳至3代。DFB波形蛋白免疫

11、熒光鑒定，鏡下藍(lán)色為DAPI染的胞核部分，綠色為FITC熒光標(biāo)記，顯示波形蛋白。
　　 2、原代ADSCs接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)48h內(nèi)逐漸貼壁，開始細(xì)胞數(shù)量較少，生長緩慢，3d后細(xì)胞換液。5-7d后細(xì)胞大量生長，鏡下細(xì)胞與成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)相似，呈梭形或者多角形，細(xì)胞排列緊密。ADSCs通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)鑒定，脂肪源干細(xì)胞表面標(biāo)記，CD29陽性，CD106陰性，CD49d陰性。體外誘導(dǎo)可向成骨、成脂肪分化。
　　 3、從細(xì)胞生長

12、曲線圖中我們可以看出，誘導(dǎo)因素的加入減緩了各誘導(dǎo)組細(xì)胞的增殖速度?？瞻捉M細(xì)胞的增殖速度都高于本類細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組。
　　 4、DFB與脂ADSCs經(jīng)2周的統(tǒng)成骨誘導(dǎo)與RA誘導(dǎo)后，茜素紅染色均有明顯的鈣結(jié)節(jié)著色，而各自的空白對(duì)照組則未見著色。各類細(xì)胞組間骨堿性磷酸酶檢測(cè)(p＜0.05)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 5、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示各干預(yù)組均有骨鈣素的表達(dá)，空白組則未見表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1、來源于D

13、FB與ADSCs都具有長梭形、多角形的形態(tài)學(xué)特征，可以形成細(xì)胞集落，形態(tài)學(xué)上無明顯差異;DFB經(jīng)免疫熒光鑒定有大量陽性細(xì)胞，可以判定該類細(xì)胞絕大多數(shù)為真皮層來源的成纖維細(xì)胞。
　　 2、ADSCs表面標(biāo)記物檢測(cè)中，特異性表面標(biāo)志物CD29表達(dá)率分別為90％以上，而CD49d陰性表達(dá)，而CD106弱表達(dá)陽性，說明該類細(xì)胞具有干細(xì)胞特征的表面標(biāo)記物，且又不是來源于造血系和上皮系的組織，該類細(xì)胞經(jīng)定向誘導(dǎo)后可以成骨、成脂肪，與間充質(zhì)干

14、細(xì)胞多向分化的功能一致?？梢耘袛嘣谥緣|筋膜結(jié)締組織中存在未分化間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 3、DFB與ADSCs在傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)與RA誘導(dǎo)的情況下，細(xì)胞內(nèi)均有鈣結(jié)節(jié)的沉積，并且兩類細(xì)胞與各自的空白對(duì)照組相比骨堿性磷酸酶活性均有顯著升高(p＜0.05)。在DFB組中，RA誘導(dǎo)的骨堿性磷酸酶活性比傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)高，而在ADSCs組中，結(jié)果卻相反。
　　 4、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示各干預(yù)組均有不同程度的骨鈣素表達(dá)。
　　 綜

15、上所述，RA與傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)液均可以促進(jìn)DFB及ADSCs的成骨分化，并且因細(xì)胞種類不同而顯著效果不同，其發(fā)生機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索研究。筋膜學(xué)認(rèn)為，以干細(xì)胞為核心的支持儲(chǔ)備系統(tǒng)在人體正常生理活動(dòng)、損傷與修復(fù)過程中發(fā)揮著重要的作用，它以自身的不斷再生與更新，源源不斷地為功能系統(tǒng)提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)以維持人體各項(xiàng)生理功能。人體的結(jié)締組織屬于支持持儲(chǔ)備系統(tǒng)的范疇，在結(jié)締組織中蘊(yùn)含著豐富的成纖維細(xì)胞與各種成體干細(xì)胞，因此對(duì)支持儲(chǔ)備系統(tǒng)功能完全透徹的