Ⅰ-帕米磷酸鈉對(duì)成骨不全成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖分化的研究Ⅱ成骨不全成纖維細(xì)胞永生化細(xì)胞系的建立.pdf

1、本文對(duì)帕米磷酸鈉對(duì)成骨不全成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖分化及成骨不全成纖維細(xì)胞永生化細(xì)胞的建立進(jìn)行了研究。本研究分為兩個(gè)部分。
　　 第一部分：帕米磷酸鈉對(duì)成骨不全成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖分化的研究
　　 目的：成骨不全(Osteogenisis Imperfecta)是一種由于間充質(zhì)組織發(fā)育不全、膠原形成障礙而造成的先天性遺傳性疾病，又稱脆骨癥( Fragililisossium)、原發(fā)性骨脆癥(ldiopathic os

2、teopsathyrosis)及骨膜發(fā)育不良(Periostealdysplasia)。目前針對(duì)成骨不全的治療主要采用手術(shù)矯形后的髓內(nèi)針固定術(shù)及術(shù)后雙磷酸鹽藥物的輸液治療。雙磷酸鹽類藥物可降低骨轉(zhuǎn)換，抑制骨吸收，臨床上常被用于治療一些骨吸收亢進(jìn)疾病，如絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、Puget's病等。其主要作用機(jī)制是通過抑制破骨細(xì)胞內(nèi)甲羥戊酸通路的關(guān)鍵酶使胞內(nèi)的小G蛋白無法異戊二烯化，從而影響破骨細(xì)胞（osteoclast,OC）的生長和分化，促其

3、凋亡。但近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，雙磷酸鹽可通過對(duì)成骨細(xì)胞的作用來間接抑制破骨細(xì)胞，而且對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stormal cells,BMSCs）和成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)的增殖和分化也有一定的影響。關(guān)于雙磷酸鹽對(duì)成纖維細(xì)胞（fibroblast，F(xiàn)B）的作用探討主要集中在雙磷酸鹽引起的頜骨壞死疾病(BRONJ)中，研究者發(fā)現(xiàn)采用不同劑量的唑來膦酸處理成纖維細(xì)胞，其中高于10μM濃度的唑來磷酸鹽即可引起成纖維

4、細(xì)胞的程序性死亡，這種死亡機(jī)制部分是由胞內(nèi)的甲羥戊酸途徑介導(dǎo)的，而較低劑量的唑來磷酸鹽則促進(jìn)細(xì)胞增殖及IL-6，IL-8等細(xì)胞因子的表達(dá)。近幾年由于成骨不全癥骨質(zhì)疏松的臨床病理表現(xiàn)，雙磷酸鹽類藥物被引入了該病的術(shù)后治療中。其中帕米磷酸鈉是主流的針對(duì)成骨不全癥的治療藥物。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的帕米磷酸鈉作用于成骨不全患者成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，研究藥物對(duì)患者細(xì)胞增殖分化的影響。
　　 方法：⑴收集成骨不全(OI)患者和對(duì)照組先天性髖脫位

5、(dislocation of the hip，DDH)患者的股骨松質(zhì)骨和大腿皮膚組織，消化處理，收集細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)及鑒定。每一實(shí)驗(yàn)組及其對(duì)照組含有三例樣本。⑵采用10-3M～1O-1OM等8個(gè)帕米磷酸鈉藥物梯度處理實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組原代成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞48h、72h。采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。采用堿性磷酸酶(ALP)活性測定法(ELISA)檢測對(duì)成骨不全癥成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞成骨分化的影響。
　

6、　 結(jié)果：①原代培養(yǎng)成骨不全癥和髖關(guān)節(jié)脫位患者成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定，可持續(xù)傳代。經(jīng)BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒染色鑒定成骨細(xì)胞堿性磷酸酶高表達(dá)，成纖維細(xì)胞低表達(dá)。②藥物作用48h和72h均有利于細(xì)胞增殖，其中72h作用效果較明顯(P<0.01)。10-3M，10-4M濃度帕米磷酸鈉明顯抑制兩組細(xì)胞增殖(P

7、細(xì)胞最佳增殖濃度分別為10-8M和10-6M(P　　 結(jié)論：帕米磷酸鈉促進(jìn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組成骨細(xì)胞及

8、成纖維細(xì)胞增殖能力和堿性磷酸酶的表達(dá)，但是對(duì)于實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的作用更明顯。針對(duì)成骨不全病人適當(dāng)?shù)慕o藥方案有利于患者骨質(zhì)增強(qiáng)。
　　 第二部分：成骨不全成纖維細(xì)胞永生化細(xì)胞系的建立。
　　 目的：細(xì)胞原代培養(yǎng)費(fèi)事費(fèi)力，而且細(xì)胞傳代次數(shù)有限，在體外長期培養(yǎng)是細(xì)胞生理功能容易發(fā)生變異，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果因細(xì)胞代數(shù)的不同而難以比較。建立永生化的細(xì)胞系可以為細(xì)胞水平的研究提供一個(gè)有效的試驗(yàn)平臺(tái)，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性。本實(shí)驗(yàn)利用SV40T能促

9、進(jìn)細(xì)胞永生化的功能，構(gòu)建含有SV40T基因的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染成骨不全成纖維細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系，為成骨不全細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定細(xì)胞平臺(tái)。
　　 方法：⑴限制性內(nèi)切酶XhoI和SalI雙酶切PAAV-SV40T,PCI-neo-hTERT得PCI-neo載體片段和SV40T基因片段。兩片段經(jīng)連接后轉(zhuǎn)化DH5α宿主菌，重組載體PCI-neo-SV40T經(jīng)PCR及酶切驗(yàn)證。⑵PCI-neo-SV40T重組質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染經(jīng)鑒定的成骨