Ⅰ-帕米磷酸鈉對成骨不全成骨細胞和成纖維細胞增殖分化的研究Ⅱ成骨不全成纖維細胞永生化細胞系的建立.pdf

1、本文對帕米磷酸鈉對成骨不全成骨細胞和成纖維細胞增殖分化及成骨不全成纖維細胞永生化細胞的建立進行了研究。本研究分為兩個部分。
　　 第一部分：帕米磷酸鈉對成骨不全成骨細胞和成纖維細胞增殖分化的研究
　　 目的：成骨不全(Osteogenisis Imperfecta)是一種由于間充質(zhì)組織發(fā)育不全、膠原形成障礙而造成的先天性遺傳性疾病，又稱脆骨癥( Fragililisossium)、原發(fā)性骨脆癥(ldiopathic os

2、teopsathyrosis)及骨膜發(fā)育不良(Periostealdysplasia)。目前針對成骨不全的治療主要采用手術(shù)矯形后的髓內(nèi)針固定術(shù)及術(shù)后雙磷酸鹽藥物的輸液治療。雙磷酸鹽類藥物可降低骨轉(zhuǎn)換，抑制骨吸收，臨床上常被用于治療一些骨吸收亢進疾病，如絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、Puget's病等。其主要作用機制是通過抑制破骨細胞內(nèi)甲羥戊酸通路的關(guān)鍵酶使胞內(nèi)的小G蛋白無法異戊二烯化，從而影響破骨細胞（osteoclast,OC）的生長和分化，促其

3、凋亡。但近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，雙磷酸鹽可通過對成骨細胞的作用來間接抑制破骨細胞，而且對間充質(zhì)干細胞（bone marrow stormal cells,BMSCs）和成骨細胞(osteoblast，OB)的增殖和分化也有一定的影響。關(guān)于雙磷酸鹽對成纖維細胞（fibroblast，F(xiàn)B）的作用探討主要集中在雙磷酸鹽引起的頜骨壞死疾病(BRONJ)中，研究者發(fā)現(xiàn)采用不同劑量的唑來膦酸處理成纖維細胞，其中高于10μM濃度的唑來磷酸鹽即可引起成纖維

4、細胞的程序性死亡，這種死亡機制部分是由胞內(nèi)的甲羥戊酸途徑介導的，而較低劑量的唑來磷酸鹽則促進細胞增殖及IL-6，IL-8等細胞因子的表達。近幾年由于成骨不全癥骨質(zhì)疏松的臨床病理表現(xiàn)，雙磷酸鹽類藥物被引入了該病的術(shù)后治療中。其中帕米磷酸鈉是主流的針對成骨不全癥的治療藥物。本實驗用不同濃度的帕米磷酸鈉作用于成骨不全患者成骨細胞和成纖維細胞，研究藥物對患者細胞增殖分化的影響。
　　 方法：⑴收集成骨不全(OI)患者和對照組先天性髖脫位

5、(dislocation of the hip，DDH)患者的股骨松質(zhì)骨和大腿皮膚組織，消化處理，收集細胞，進行原代培養(yǎng)及鑒定。每一實驗組及其對照組含有三例樣本。⑵采用10-3M～1O-1OM等8個帕米磷酸鈉藥物梯度處理實驗組和對照組原代成骨細胞和成纖維細胞48h、72h。采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測藥物對細胞增殖的影響。采用堿性磷酸酶(ALP)活性測定法(ELISA)檢測對成骨不全癥成骨細胞和成纖維細胞成骨分化的影響。
　

6、　 結(jié)果：①原代培養(yǎng)成骨不全癥和髖關(guān)節(jié)脫位患者成骨細胞和成纖維細胞，細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定，可持續(xù)傳代。經(jīng)BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒染色鑒定成骨細胞堿性磷酸酶高表達，成纖維細胞低表達。②藥物作用48h和72h均有利于細胞增殖，其中72h作用效果較明顯(P<0.01)。10-3M，10-4M濃度帕米磷酸鈉明顯抑制兩組細胞增殖(P

7、細胞最佳增殖濃度分別為10-8M和10-6M(P　　 結(jié)論：帕米磷酸鈉促進實驗組和對照組成骨細胞及

8、成纖維細胞增殖能力和堿性磷酸酶的表達，但是對于實驗組細胞的作用更明顯。針對成骨不全病人適當?shù)慕o藥方案有利于患者骨質(zhì)增強。
　　 第二部分：成骨不全成纖維細胞永生化細胞系的建立。
　　 目的：細胞原代培養(yǎng)費事費力，而且細胞傳代次數(shù)有限，在體外長期培養(yǎng)是細胞生理功能容易發(fā)生變異，造成實驗結(jié)果因細胞代數(shù)的不同而難以比較。建立永生化的細胞系可以為細胞水平的研究提供一個有效的試驗平臺，保證實驗結(jié)果的一致性。本實驗利用SV40T能促

9、進細胞永生化的功能，構(gòu)建含有SV40T基因的真核表達載體并轉(zhuǎn)染成骨不全成纖維細胞構(gòu)建穩(wěn)定細胞系，為成骨不全細胞水平實驗提供穩(wěn)定細胞平臺。
　　 方法：⑴限制性內(nèi)切酶XhoI和SalI雙酶切PAAV-SV40T,PCI-neo-hTERT得PCI-neo載體片段和SV40T基因片段。兩片段經(jīng)連接后轉(zhuǎn)化DH5α宿主菌，重組載體PCI-neo-SV40T經(jīng)PCR及酶切驗證。⑵PCI-neo-SV40T重組質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染經(jīng)鑒定的成骨