化療聯(lián)合CIK細(xì)胞治療惡性腫瘤的相關(guān)研究及在卵巢癌臨床治療中的觀察.pdf

1、卵巢癌發(fā)病隱匿，大部分患者就診時(shí)已經(jīng)是晚期，位居?jì)D科腫瘤患者致死首位。結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率也位居消化系統(tǒng)腫瘤首位。因此，它們都迫切需要尋找更有效的治療手段。隨著腫瘤免疫學(xué)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，腫瘤免疫治療已成為腫瘤的第四大治療模式。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cells，CIK)兼具有強(qiáng)大的抗瘤活性和增殖活性，又具有非MHC限制性殺瘤的優(yōu)點(diǎn)，近些年已經(jīng)得到廣泛關(guān)注并應(yīng)用于多種實(shí)體瘤的臨床治

2、療，但對(duì)卵巢癌治療報(bào)道少見(jiàn)。
　　本文首先通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究順鉑(cis-Dichloro diamine in platinum，CDDP或DDP)、CIK細(xì)胞及其聯(lián)合對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3的殺傷效應(yīng)，接著通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究氟尿嘧啶(5-FU)、CIK細(xì)胞及其聯(lián)合對(duì)小鼠結(jié)腸癌移植瘤生長(zhǎng)的作用，初步探討其作用機(jī)制。最后，回顧分析本中心6例CIK細(xì)胞治療的卵巢癌患者臨床資料，初步探討CIK細(xì)胞治療卵巢癌的安全性及有效性，為卵巢癌探尋

3、生物治療策略。
　　第一部分 DDP聯(lián)合CIK細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3的殺傷效應(yīng)
　　目的:探討DDP、CIK細(xì)胞及其聯(lián)合對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3的殺傷效應(yīng)并初步探討其機(jī)制。
　　方法:利用人外周血單核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC）在體外用多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)生成CIK細(xì)胞，于培養(yǎng)第0、7、14、21、28及35天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及流式細(xì)胞術(shù)分析CD3+CD56+雙

4、陽(yáng)性細(xì)胞百分比;于培養(yǎng)14天收獲CIK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，用含有CIK細(xì)胞培養(yǎng)液上清的培養(yǎng)液培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV-3細(xì)胞，于培養(yǎng)24及48小時(shí)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)SKOV-3細(xì)胞的凋亡情況，同時(shí)設(shè)正常培養(yǎng)的SKOV-3細(xì)胞作對(duì)照組;殺傷實(shí)驗(yàn)分為A1～4 CIK細(xì)胞作用組（效靶比分別為5∶1、10∶1、20∶1、40∶1）、B1～7 DDP作用組（DDP濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml）及C1～2 CI

5、K聯(lián)合DDP作用組(DDP濃度均為2.5μg/ml，效靶比分別為5∶1和10∶1）。同時(shí)設(shè)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞作對(duì)照孔。于24h和48 h采用MTT法檢測(cè)各組對(duì)SKOV-3的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。
　　結(jié)果:CIK細(xì)胞體外培養(yǎng)第0、7、14、21、28及35天細(xì)胞計(jì)數(shù)依次為(1.8±0.2)×107、（14.67±1.53）×107、（230.0±20.0）×107、（225.0±22.91）×107及(220.0±17.32)×107，細(xì)胞

6、數(shù)于培養(yǎng)第21天時(shí)約增加127.78倍，達(dá)到增殖高峰;CD3+CD56+雙陽(yáng)性細(xì)胞的百分含量依次為(0.47±0.17)％、（11.30±1.96）％、（35.50±2.30）％、（38.23±1.92）％、（31.40±3.91）％和（28.61±3.45）％，到21天也達(dá)到增殖高峰;SKOV-3與CIK細(xì)胞培養(yǎng)液上清共培養(yǎng)24 h及48 h后凋亡率分別為（12.30±1.47）％和（27.13±2.03）％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0

7、.05)。對(duì)照組24h及48 h凋亡率分別為（0.62±0.35）％和（0.65±0.38）％，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);A1～4CIK作用組24 h抑制率分別為（16.52±2.52）％、（24.18±4.05）％、（35.98±5.19）％及（53.98±5.02）％，48 h抑制率分別為（24.20±5.59）％、(41.23±3.64)％、（57.27±6.68）％及（74.74±6.87）％。在相同時(shí)間各組間細(xì)胞抑制率

8、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，相同效靶比24h和48 h抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);CIK細(xì)胞對(duì)SKOV-3細(xì)胞的抑制率隨著效靶比的提高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而提高;B1～7 DDP作用組24 h抑制率分別為（15.09±4.03）％、(25.95±3.36)％、（37.11±3.05）％、（50.07±5.21）％、（62.93±5.85）％、(77.93±3.28)％及（92.55±1.39）％，48 h抑制率分別增為（2

9、3.42±5.63）％、（32.39±1.47）％、（46.04±2.76）％、（60.46±3.26）％、（72.77±2.38）％、（86.42±1.46）％及（96.24±0.59）％。除外DDP0.625μg/ml組24 h和48 h抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.102)，其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DDP對(duì)SKOV-3細(xì)胞的抑制率也隨著藥物濃度的提高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而提高;C1～2 CIK聯(lián)合DDP作用組24 h抑制率分別為

10、（50.50±3.69）％和（68.19±2.07）％，48h抑制率分別為（69.87±2.67）％和（80.11±6.87）％。CIK細(xì)胞聯(lián)合DDP與單一處理因素相比，對(duì)SKOV-3的生長(zhǎng)抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但析因分析結(jié)果顯示，低劑量組（效靶比為5∶1）24 h和48 h抑制率未見(jiàn)到協(xié)同效應(yīng)（P值分別為0.171和0.895），而高劑量組（效靶比為10∶1）24 h和48 h抑制率見(jiàn)到協(xié)同效應(yīng)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:P

11、BMC在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子刺激誘導(dǎo)下可大量擴(kuò)增獲得CIK細(xì)胞，其主要效應(yīng)細(xì)胞(CD3+CD56+CIK)在第14～21天為高表達(dá)平臺(tái)期，在此期間可獲得較為理想的效應(yīng)細(xì)胞;CIK細(xì)胞可通過(guò)分泌細(xì)胞因子并誘導(dǎo)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞凋亡發(fā)揮較強(qiáng)的殺傷作用;聯(lián)合CIK細(xì)胞治療可明顯增強(qiáng)DDP對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的殺傷作用。
　　第二部分氟尿嘧啶聯(lián)合CIK細(xì)胞在小鼠結(jié)腸癌模型體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:探討氟尿嘧啶(flu

12、orouracil，5-FU)、CIK細(xì)胞以及5-FU聯(lián)合CIK細(xì)胞對(duì)小鼠結(jié)腸癌移植瘤生長(zhǎng)的作用。
　　方法:建立BALB/C小鼠結(jié)腸癌模型，在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠CIK細(xì)胞，于第0和7天進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)CIK主要效應(yīng)細(xì)胞表型分析。10只荷瘤鼠隨機(jī)分兩組，一組給5-FU(12.5 mg/kg)當(dāng)天腹腔注射，另一組給予NS(0.2ml/只)腹腔注射作對(duì)照，第十天采用流式細(xì)胞儀分析荷瘤鼠腫瘤組織中淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒性T細(xì)胞活化抗原-4（cyto

13、toxic T lymphocyte-activation antigen4，CTLA-4）和非淋巴細(xì)胞CD80、CD86表達(dá)。另取40只荷瘤鼠隨機(jī)分成四組，A組（正常對(duì)照組）:NS(0.2 ml腹腔灌注，d0)+NS(0.2ml尾靜脈注射，d3);B組（5-FU組）:5-FU(12.5 mg/kg腹腔灌注，d0)+NS(0.2ml尾靜脈注射，d3);C組（CIK組）:NS(0.2ml腹腔灌注，d0)+CIK（1×107尾靜脈注射，d3

14、）;D組(5-FU+CIK組):5-FU（12.5 mg/kg腹腔灌注，d0）+CIK（1×107尾靜脈注射，d3）。觀察腫瘤生長(zhǎng)并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，生存分析采用Kaplan-Meier法及l(fā)og-rank檢驗(yàn)。用藥第10天各組處死5只小鼠，采用RT-PCR法檢測(cè)四組腫瘤組織中IFN-γ和TNF-α表達(dá)量。
　　結(jié)果:小鼠CIK主要效應(yīng)細(xì)胞在體外擴(kuò)增第7天達(dá)到（18.4±6.8）％。與對(duì)照組相比，5-FU處理后小鼠移植瘤組織中CD

15、45+細(xì)胞表面CTLA-4表達(dá)量提高，且CD45-細(xì)胞CD80和CD86表達(dá)量增加;5-FU聯(lián)合CIK細(xì)胞治療組小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度明顯慢于單因素治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);5-FU聯(lián)合CIK細(xì)胞治療可提高腫瘤組織IFN-γ與TNF-α表達(dá)量，且聯(lián)合治療組與單治療組中IFN-γ的表達(dá)量之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:5-FU聯(lián)合CIK細(xì)胞治療對(duì)結(jié)腸癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用大于單獨(dú)應(yīng)用，且可提高BALB/

16、C小鼠結(jié)腸癌模型的免疫功能。
　　第三部分化療聯(lián)合CIK細(xì)胞治療卵巢癌的臨床觀察
　　目的:初步探討CIK細(xì)胞治療卵巢癌的安全性和有效性，為卵巢癌探尋生物治療策略。
　　方法:利用接受常規(guī)手術(shù)和化療結(jié)束后卵巢癌患者外周血分離出單個(gè)核細(xì)胞，在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)出CIK細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析其表型特征。將體外培養(yǎng)第14～21天的CIK細(xì)胞通過(guò)靜脈回輸給患者，流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者外周血淋巴細(xì)胞表型變化，回顧性觀察6例接受

17、CIK細(xì)胞治療的卵巢癌患者資料，觀察患者治療前后卡式評(píng)分(Karnofsky performance score，KPS)差異、腫瘤指標(biāo)差異、外周血T細(xì)胞亞群分布及治療后相關(guān)毒副反應(yīng)。
　　結(jié)果:有5例治療后KPS較治療前明顯提升，另外1例治療后KPS保持不變。所有接受CIK細(xì)胞治療的患者均未出現(xiàn)明顯毒副作用。1例Ⅲ期EOC患者手術(shù)聯(lián)合化療治療后CA199升高，在接受CIK細(xì)胞治療3個(gè)療程后，CA199逐漸下降至正常。目前狀況良好

18、，腫瘤標(biāo)記物和影像學(xué)隨訪沒(méi)有腫瘤復(fù)發(fā)跡象，無(wú)瘤生存期(progression free survival，PFS)已達(dá)到3年。1例Ⅱ期透明細(xì)胞癌合并漿液性癌患者，接受CIK細(xì)胞治療2個(gè)療程，PFS已接近4年，隨訪瘤標(biāo)和影像學(xué)檢查無(wú)腫瘤復(fù)發(fā)跡象。另外1例II期EOC患者接受8個(gè)療程CIK細(xì)胞治療后，PFS已達(dá)5年，目前狀況良好，也沒(méi)有腫瘤復(fù)發(fā)跡象。
　　結(jié)論:CIK細(xì)胞治療卵巢癌可改善患者的生存質(zhì)量，是一種有希望的治療方法。

19、　　綜上所述，本文通過(guò)對(duì)化療聯(lián)合CIK細(xì)胞治療腫瘤的基礎(chǔ)研究和治療卵巢癌病例的回顧分析，我們認(rèn)為，CIK細(xì)胞可在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子刺激下誘導(dǎo)擴(kuò)增，第14～21天可獲得較為理想的效應(yīng)細(xì)胞;CIK細(xì)胞可通過(guò)分泌細(xì)胞因子并誘導(dǎo)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞凋亡發(fā)揮較強(qiáng)的殺傷作用;聯(lián)合CIK細(xì)胞治療可增強(qiáng)DDP對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的殺傷作用;5-FU聯(lián)合CIK細(xì)胞治療對(duì)BALB/C小鼠結(jié)腸癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用大于單獨(dú)應(yīng)用5-FU或CIK細(xì)胞，且可