干細(xì)胞移植在肝臟惡性腫瘤治療中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(以下簡稱肝癌)是我國常見的惡性腫瘤之一，惡性度高，預(yù)后差，在各種惡性腫瘤中，其病死率現(xiàn)已居第二位，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。盡管以手術(shù)為主的綜合治療使肝癌的預(yù)后獲得了一定程度的提高，但即使較為早期的小肝癌切除后的復(fù)發(fā)率也不低于50％，術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為影響肝癌預(yù)后最為主要的因素，如何克服這一難題，成為征服肝癌的關(guān)鍵. 由于傳統(tǒng)治療手段的局限性明顯，免疫治療作為新的治療方法在肝癌治療中已經(jīng)成為新的研究熱點(diǎn)。細(xì)胞因子及腫瘤

2、疫苗是近年研究較多的方法，這類方法試圖通過刺激自身免疫系統(tǒng)抗腫瘤潛力達(dá)到治療腫瘤的目的，然而腫瘤患者免疫系統(tǒng)的缺陷，使這類方法無法獲得滿意療。20世紀(jì)70年代，隨著骨髓移植技術(shù)的開展，人們開始注意到同種異基因造血干細(xì)胞的抗腫瘤潛力，同種異基因HSCT(hematopoieticstemcelltransplantation，干細(xì)胞移植)為患者引入了一整套健康的免疫系統(tǒng)，因此可以更為有效地清除腫瘤，首先，患者對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受，使強(qiáng)化自

3、體免疫系統(tǒng)抗腫瘤功能的治療方案效果不理想，只有引入正常免疫系統(tǒng)，才有可能克服這一缺陷，因?yàn)榻】档墓w免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞不存在耐受。第二，與受體免疫細(xì)胞相比，供體T細(xì)胞可以識(shí)別包括次要組織相容性抗原在內(nèi)的范圍更廣泛的受體抗原系統(tǒng)，這其中極有可能包括腫瘤特異性和非特異性抗原。第三，由于上皮性腫瘤與其起源的正常組織細(xì)胞之間具有相同的MHC-Ⅰ，因此當(dāng)發(fā)生1GVHD時(shí)這類腫瘤同樣可以成為免疫攻擊的靶細(xì)胞。 為了探討干細(xì)胞移植技術(shù)在肝癌治

4、療中的應(yīng)用前景，我們?cè)噲D建立一種人-鼠干細(xì)胞移植嵌合體模型，并希望在這一模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步評(píng)估人源干細(xì)胞對(duì)人肝癌細(xì)胞的抑制及殺傷作用.在第一部分實(shí)驗(yàn)中，我們比較了不同的的臍血干細(xì)胞分離方法，找到了一種高效簡便的分離方法，為以后的研究打下了基礎(chǔ).在第二部分中，我們?yōu)槁闶筮M(jìn)行低劑量全身照射以誘導(dǎo)人干細(xì)胞的在其體內(nèi)的嵌合.干細(xì)胞輸注后4周，通過流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)，所有動(dòng)物均嵌合成功.在第三部分中，我們通過免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步精確衡量了同種

5、異體干細(xì)胞對(duì)肝癌的殺傷作用. 第一部分：臍血有核細(xì)胞(NC)的分離純化 目的：尋找一種簡單高效分離人臍血干細(xì)胞的方法，為以后的試驗(yàn)打下基礎(chǔ). 方法：采集足月順產(chǎn)胎兒臍血10份，分別以6％HES+NH4CL破紅細(xì)胞液法和Ficoll離心兩種方法進(jìn)行分離，比較兩者對(duì)單核細(xì)胞的分離效率.同時(shí)為了衡量兩種方法對(duì)造血干細(xì)胞的回收率，進(jìn)一步以流式細(xì)胞術(shù)檢測分離的單核細(xì)胞中CD34+含量. 結(jié)果：6％HES+NH4CL

6、破紅細(xì)胞液分離法的單核細(xì)胞回收率明顯高于Ficoll離心法，兩者的回收率分別為(83.08±3.49vs53.26±6.17)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01).CD34+細(xì)胞回收率分別為(74.20±3.38vs42.08±3.55)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01). 結(jié)論：6％HES+NH4CL破紅細(xì)胞液分離法與Ficoll離心法相比，在單核細(xì)胞分離率及CD34+回收率兩方面都優(yōu)于后者，是一種較好的分離方法，成功建立這一方

7、法為下一步試驗(yàn)打下了基礎(chǔ). 第二部分：人鼠嵌合干細(xì)胞移植肝癌小鼠模型的建立 目的：建立人—裸鼠干細(xì)胞移植模型，穩(wěn)定嵌合后在這一模型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建人肝癌裸鼠模型，以評(píng)估同種異體干細(xì)胞對(duì)肝癌的抑制及殺傷作用. 方法：選取裸小鼠(BALB/C-nu/nu)22只，分為干細(xì)胞移植組(10)，LAK細(xì)胞輸注組(6)，生理鹽水對(duì)照組(6).三組小鼠給予Co60350CGy照射，部分破壞小鼠造血功能為人源造血干細(xì)胞的植入創(chuàng)

8、造條件.三組小鼠照射后分別經(jīng)尾靜脈注射人臍血造血干細(xì)胞(5×107/0.2ml)，人源LAK細(xì)胞(5×107/0.2ml)和等量生理鹽水，四周后干細(xì)胞移植組行流式細(xì)胞術(shù)檢測嵌合情況.將SMMC-7721肝癌細(xì)胞5×106/0.2ml接種于小鼠右前肢腋下，觀察各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活及腫瘤生長情況. 結(jié)果：1.Co60照射后干細(xì)胞移植組裸鼠無死亡，造血功能逐漸恢復(fù)，照射后四周流式細(xì)胞術(shù)檢測CD34+4.7％，CD45+細(xì)胞含量為6.5％

9、。第五周時(shí)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)恢復(fù)至照射前水平(1.62±0.44vsl.56±0.46，p＞0.05)，接種肝癌細(xì)胞后3只未成瘤，其余7只腫瘤生長緩慢. 2.Co60照射后LAK細(xì)胞輸注組死亡2只裸鼠，該組動(dòng)物造血功能于第7周時(shí)恢復(fù)至照射前水平(1.57±0.32vsl.57±0.54，p＞0.05)，接種腫瘤后全部成瘤，裸鼠體重?zé)o下降，瘤體生長較迅速. 3.生理鹽水對(duì)照組照射后死亡1只，該組動(dòng)物造血功能恢復(fù)較慢第7周時(shí)恢

10、復(fù)至照射前水平(1.64±0.39vsl.59±0.63，p＞0.05)，腫瘤接種后迅速成瘤. 結(jié)論：成功建立了人-裸鼠干細(xì)胞移植模型，經(jīng)檢測移植組裸鼠體內(nèi)可見較高含量人源細(xì)胞.三組動(dòng)物成瘤情況差異明顯，初步可以判斷干細(xì)胞移植對(duì)SMMC-7721細(xì)胞有一定的抑制作用. 第三部分：干細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)研究 目的：運(yùn)用病理學(xué)及免疫學(xué)研究手段，準(zhǔn)確評(píng)估同種異體干細(xì)胞對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的抑制及殺傷作用. 方法：

11、三組動(dòng)物于接種腫瘤后6周處死，分別進(jìn)行以下檢測：①取干細(xì)胞移植組外周血檢測CD45+，CD34+水平，評(píng)估嵌合穩(wěn)定性.②放射免疫法檢測血清AFP水平，比較三組之間腫瘤生長情況的差異.③常規(guī)病理學(xué)檢查：比較三組腫瘤生長情況，并觀察有無腫瘤轉(zhuǎn)移.④取三組腫瘤送流式細(xì)胞術(shù)檢查觀察壞死及凋亡情況，比較組間差異.⑤免疫組化檢查：觀察實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中人源CD3+，CD8+細(xì)胞對(duì)腫瘤組織的殺傷.⑥細(xì)胞毒試驗(yàn)：三組動(dòng)物脾臟細(xì)胞與SMMC-7721細(xì)胞體

12、外混合培養(yǎng)，MTT法觀察對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用. 結(jié)果：1.干細(xì)胞移植組外周血檢測CD45+，CD34+水平較4周時(shí)有比較明顯的下降，但仍可以檢測到，說明嵌合穩(wěn)定性稍差但可以滿足實(shí)驗(yàn)要求.2.干細(xì)胞移植組血清AFP水平與LAK細(xì)胞組相和生理鹽水對(duì)照組相比明顯較低(48.55±7.47vs90.15±13.54vs100.35±12.76μg/L)3.病理學(xué)檢查可見：干細(xì)胞移植組腫瘤壞死明顯，兩組對(duì)照壞死程度明顯較輕，三組均未見遠(yuǎn)處

13、轉(zhuǎn)移.4.三組腫瘤組織流式細(xì)胞學(xué)檢查可見：干細(xì)胞移植組腫瘤壞死率為37.83±10.69％，LAK組為16.17±3.50％，生理鹽水對(duì)照組為13.71±2.58％，干細(xì)胞移植組與兩組對(duì)照相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.5.免疫組織化學(xué)檢查：干細(xì)胞移植組腫瘤組織中可見大量人源CD3+，CD8+細(xì)胞浸潤，壞死組織周圍更加明顯.LAK細(xì)胞輸注組中未觀察到這一現(xiàn)象.6.細(xì)胞毒試驗(yàn)表明干細(xì)胞移植組脾臟細(xì)胞對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的殺傷活力明顯高于兩組對(duì)照