突觸蛋白-Ⅰ在胚胎干細胞的神經分化和移植治療腦缺血中的作用.pdf

1、研究背景和目的 近年來，再生醫(yī)學給腦缺血帶來了新的希望。胚胎干細胞(embryonicstemcell，ESC)由于具有很強的增殖和分化能力、可被大量地誘導成為神經細胞而成為再生醫(yī)學移植供體的理想來源。由于ESC直接移植體內具有形成畸胎瘤的危險，因此應用ESC治療腦缺血一般先在體外誘導分化出神經前體細胞或神經細胞，然后再移植進腦內。也就是說ESC治療腦缺血的過程分為兩部分，一是體外誘導ESC向神經細胞的分化，一是移植進腦內的ES

2、C的遷移、增殖以及與宿主腦組織的整合。細胞分化是細胞特異基因在時間和空間上序貫性表達的結果，即哪些基因被激活和在什么時間與位點被激活，因此ESC向神經細胞的分化有著極其復雜的調控機制。同樣地，ESC在宿主腦內的遷移、增殖和整合也受著自身機制和宿主機制的雙重調控。因此尋求這一過程的可調控點或調控切入點是更好地應用ESC治療腦缺血的關鍵環(huán)節(jié)。突觸蛋白-Ⅰ(synapsin-Ⅰ)是一個有代表性的與突觸囊泡相關的磷酸蛋白，在神經的早期發(fā)育分化和

3、神經遞質釋放的過程中起著重要的作用。我們既往的研究也發(fā)現(xiàn)synapsin-Ⅰ在腦缺血再灌流后存在表達的變化。既然synapsin-Ⅰ與神經分化和腦缺血均密切相關，我們把synapsin-Ⅰ作為誘導ESC分化為神經細胞移植治療腦缺血這一過程的可調控點或調控切入點的候選基因。通過研究synapsin-Ⅰ在ESC的神經分化及其移植治療腦缺血這一過程的作用，驗證synapsin-Ⅰ可否成為這一過程的可調控點或調控切入點，為進一步研究這一過程的調

4、控機制提供依據(jù)。 方法 1.采用五步法和維甲酸法兩種不同的途徑體外誘導ESC向神經細胞分化，并以另一種可向神經細胞分化的腫瘤細胞——PC12細胞的誘導過程作參照，從不同的途徑、不同的細胞進行比較，通過免疫組織化學、RT-PCR、western-blot方法觀察這一過程synapsin-Ⅰ的表達變化，找出synapsin-Ⅰ在誘導細胞向神經細胞分化過程中表達變化的共同規(guī)律。 2.于不同誘導階段采用反義寡核苷酸技術抑

5、制ESC和PC12細胞的synapsin-Ⅰ表達，比較抑制與不抑制的形態(tài)學、分化效率及其它神經特異性蛋白表達的變化，觀察這種干預對細胞的神經分化過程的影響。 3.建立大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)模型和PC12細胞缺氧+血清剝奪模型，通過免疫組織化學方法觀察短暫腦缺血/缺氧+血清剝奪，再灌流/復給氧+血清后突觸蛋白-Ⅰ的表達變化規(guī)律。 4.采用transwell小室共培養(yǎng)ESC和遭受缺血缺氧打擊的已分化的PC12細胞，模

6、擬ESC移植遷移的過程，建立ESC移植治療腦缺血的離體模型。采用Hoechst染色法和流式細胞儀計算ESC的遷移率，比較分化與未分化ESC的遷移能力、受缺血缺氧打擊與未受缺血缺氧打擊PC12細胞對ESC的吸引力；然后采用反義寡核苷酸技術抑制ESC的synapsin-Ⅰ表達，觀察抑制后ESC遷移能力和形態(tài)學的改變。 結果 1.結合形態(tài)學和其它神經特異性指標的變化，synapsin-Ⅰ在ESC和PC12細胞向神經細胞分化的過

7、程中具有早期即有表達，后逐漸升高，至分化成熟階段達最高，后期又逐漸下降的變化規(guī)律。 2.于不同誘導分化階段抑制synapsin-Ⅰ的表達均可導致ESC向神經細胞分化的進程較正常滯后和神經分化效率的降低，以早期分化階段明顯。第三、四階段抑制synapsin-Ⅰ的表達導致第三、四階段末神經前體細胞(nestin陽性細胞)比例較正常分化明顯減少(第三階段末：76.2±5.1％VS68.5±4.2％，P＜0.05，第四階段末：90.2±

8、4.3％VS75.1±4.7％，P＜0.01)，細胞的突起伸長速度減慢。第五階段抑制synapsin-Ⅰ的表達導致第五階段末神經元樣細胞、MAP2陽性細胞的比例減少(41.2±2.7％VS30.7±3.2％，P＜0.05)，細胞之間的聯(lián)系減少。 抑制PC12細胞synapsin-Ⅰ的表達后也出現(xiàn)整個分化過程滯后的情況，大部分細胞突起較正常誘導分化過程短，誘導1d、4d、7d、10d分化細胞的百分率由正常分化過程的1.81±0.4

9、0％、45.13±4.17％、90.26±4.68％、84.66±4.81％降至0.33±0.46％、9.78±3.47％、45.3±7.98％、34.2±5.89％，轉染組與正常分化組比較差異有顯著性意義(P＜0.01)。 3.MCAO模型和PC12細胞缺氧模型均顯示短暫腦缺血/缺氧，再灌流/復給氧12h內synapsinⅠ的表達無明顯變化，再灌流/復給氧后24h降低(P＜0.01)，至72h恢復至對照組水平。 4.遭

10、受缺氧缺血打擊后的PC12細胞比未遭受缺氧缺血打擊的PC12細胞更能吸引ESC的遷移，遷移向缺血PC12細胞的ESC比遷移向未缺血的PC12細胞增多68％以上甚至數(shù)倍。 抑制synapsin-ⅠmRNA的表達后，ESC的遷移細胞數(shù)較未轉染前明顯減少(P＜0.05)。 PC12細胞遭受缺血打擊后24h移植的未分化和已分化ESC遷移數(shù)明顯高于立即移植的ESC遷移數(shù)，兩者的比值分別為1.97和2.04。 結論

11、1.synapsin-Ⅰ在ESC的體外神經分化過程中起著重要的作用，而且在分化的不同階段所起的作用不同，在分化的早期可能起著更為重要的作用。 2.在ESC移植治療腦缺血的離體研究中、ESC的遷移數(shù)受宿主細胞內環(huán)境的影響，并可能與ESC自身和宿主細胞的synapsin-Ⅰ的表達水平有關。 3.synapsin-Ⅰ可能參與了ESC向神經細胞分化及移植治療腦缺血過程的調控機制，有望成為這一過程的理想調控點或調控切入點。