蛋白激酶C調(diào)控小鼠胚胎干細胞定向分化為神經(jīng)樣細胞的分子機制.pdf

1、目的研究5種蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)亞型PKC alpha(α)、PKCbeta(β)、PKC gamma(γ)、PKC delta(δ)和PKC epsilon(ε)在小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cells,ES細胞)株ES-D3細胞定向誘導分化為神經(jīng)樣細胞過程中的時空表達變化,探討PKC信號對ES細胞定向誘導分化中發(fā)育基因(pax-6、slit-2、netrin-1)表達的影響,試圖發(fā)

2、現(xiàn)PKC調(diào)控ES細胞定向分化為神經(jīng)細胞的分子機制.方法ES-D3細胞株用普通ES細胞培養(yǎng)液培養(yǎng),應用經(jīng)典的4-/4+法,經(jīng)胚胎體(embryoid bodies,EBs)階段后,用5×10<'-7>M維甲酸(retinoic acid,RA)誘導,用NSE和NF-200來鑒定分化細胞的類型,在誘導后第4天用免疫組織化學,在誘導后第1、3、5、7和14天用Western印跡和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈(RT-PCR)方法來檢測PKC亞型的表達變化;用

3、RT-PCR方法測定細胞的發(fā)育基因的mRNA表達情況,并觀察了PKC激活劑佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)和抑制劑D-鞘氨醇對它們表達的影響.將PKCα cDNA正義和反義真核表達載體質(zhì)粒,應用脂質(zhì)體Lipofectin轉(zhuǎn)染ES-D3細胞,經(jīng)Western印跡等檢驗,成功構建了穩(wěn)定過表達和表達反義PKCα的ES-D3細胞模型,觀察PKCα亞類對發(fā)育基因表達的影響.結(jié)論(1)PKC<,α>、