過表達synoviolin促進功能性滑膜形成的實驗研究.pdf

1、1.背景與目的
　　 肌腱損傷修復(fù)術(shù)后形成限制性粘連對手外科醫(yī)生而言是一個巨大的挑戰(zhàn)。目前，臨床上通常使用無滑膜肌腱段作為移植材料修復(fù)屈肌腱缺損。但是，在愈合過程中通常都伴隨有術(shù)后粘連的發(fā)生。這主要是由于無滑膜肌腱表面沒有滑膜組織覆蓋。滑膜在肌腱愈合與粘連防治中發(fā)揮著重要的作用。它通過阻止外源性成纖維細胞的過度增生以及腱周組織與肌腱的接觸抑制了外源性愈合；滑膜分泌的滑液能促進肌腱滑動，減少摩擦，營養(yǎng)肌腱，增強肌腱的內(nèi)源性愈合。如

2、果能使易于取材的無滑膜肌腱表面形成滑膜組織，即無滑膜肌腱滑膜化，將對粘連防治起到巨大的作用。為此，我們一直在尋找簡單有效地無滑膜肌腱滑膜化方法。
　　 2003年，日本科學(xué)家在類風濕性關(guān)節(jié)炎病人的滑膜細胞中發(fā)現(xiàn)了一種新基因synoviolin。它是一種E3泛素酶，含有RING-H2基序和六個跨膜結(jié)構(gòu)域，主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，它在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解系統(tǒng)(ER-associated degradation)中發(fā)揮重要的作用。Synov

3、iolin在風濕關(guān)節(jié)炎病人的滑膜細胞中表達增高，它通過抑制滑膜細胞凋亡使滑膜細胞過度生長和增殖。既然synoviolin能夠使滑膜細胞增殖，而無滑膜肌腱滑膜化可以有效地防粘連，如果將過表達synoviolin的滑膜細胞包裹在無滑膜肌腱周圍，將可能在肌腱表面形成一層滑膜，從而促進肌腱的愈合并減輕粘連的發(fā)生。
　　 本課題的目的就是明確synoviolin對滑膜細胞的增殖作用，探討過表達synoviolin使無滑膜肌腱滑膜化的可行性

4、及有效性，為無滑膜肌腱滑膜化抗粘連提供簡單有效的方法。
　　 2.方法
　　 2.1.synoviolin慢病毒表達載體的構(gòu)建
　　 利用Gateway技術(shù)構(gòu)建增強綠色熒光蛋白(EGFP)和synoviolin基因共表達的慢病毒表達載體，通過與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細胞，包裝生產(chǎn)慢病毒，經(jīng)超速離心濃縮收集病毒顆粒，采用轉(zhuǎn)染293FT細胞的方法測定慢病毒功能滴度，為后續(xù)研究提供了高效的轉(zhuǎn)基因平臺。
　　

5、2.2.synoviolin在滑膜細胞的表達及對其增殖、HA分泌的作用
　　 采用酶消化法分離純化原代滑膜細胞，免疫組化染色對其進行鑒定。慢病毒感染滑膜細胞后，RT-PCR和Western Blot檢測synoviolin mRNA和蛋白質(zhì)表達水平。采用MTT法和流式細胞術(shù)檢測synoviolin對滑膜細胞增殖的影響，ELISA技術(shù)檢測過表達synoviolin后滑膜細胞分泌透明質(zhì)酸的情況。
　　 2.3.synovio

6、lin促進功能性滑膜形成的作用
　　 手術(shù)分離取出兔的無滑膜肌腱段，將Lenti-synoviolin和Lenti-lacZ感染的滑膜細胞分別與肌腱共培養(yǎng)，體外進行無滑膜肌腱的滑膜化。HE染色和掃描電鏡觀察肌腱表面滑膜形成情況，切片細胞計數(shù)比較滑膜形成的速度，阿辛藍染色法檢測共培養(yǎng)形成的滑膜分泌透明質(zhì)酸的情況。
　　 3.結(jié)果
　　 3.1.synoviolin慢病毒表達載體的構(gòu)建
　　 3.1.1.PC

7、R擴增獲得含SallI和BamHI酶切位點的synoviolin目的基因片段；
　　 3.1.2.將目的基因連接到pMD18-T載體中進行擴增：
　　 3.1.3.經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化等步驟后得到真核表達載體pIRES2-synoviolin-egfp；
　　 3.1.4.雙酶切獲得synoviolin-egfp基因片段，將其克隆至pENTR1A的多克隆位點得到入門克隆pENTR1A-synoviolin-egfp

8、；
　　 3.1.5.利用Gateway技術(shù)的LR重組反應(yīng)將synoviolin-egfp基因片段轉(zhuǎn)入目的載體，獲得慢病毒表達載體pLenti4/TO/V5-DEST-synoviolin-egfp；
　　 3.1.6.將慢病毒表達載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細胞，包裝獲得慢病毒；
　　 3.1.7.超速離心濃縮收集病毒顆粒，轉(zhuǎn)染293FT細胞后通過熒光表達測定病毒滴度。Lenti-synoviolin的病毒滴

9、度為1×108TU/mL。
　　 3.2.synoviolin在滑膜細胞的表達及對其增殖、HA分泌功能的影響
　　 3.2.1.滑膜細胞的形態(tài)及鑒定
　　 原代培養(yǎng)的滑膜細胞經(jīng)HE染色，普通光鏡下，細胞呈梭型或柱形，細胞核呈卵圓形位于細胞中央，核仁明顯。免疫組化染色檢測發(fā)現(xiàn)滑膜細胞對vimentin蛋白表達陽性，CD14、CD68蛋白表達陰性，說明該細胞來源于中胚層，并具有成纖維細胞的特點，是滑膜細胞B型細胞，即

10、成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)。
　　 3.2.2.滑膜細胞轉(zhuǎn)染Lenti-synoviolin后過表達synoviolin
　　 慢病毒感染滑膜細胞48h后，RT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，Lenti-synoviolin感染滑膜細胞后synoviolin基因的mRNA和蛋白水平均有顯著的增高。
　　 3.2.3.過表達synov

11、iolin促進滑膜細胞增殖并改變其細胞周期
　　 采用MTT法分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，滑膜細胞轉(zhuǎn)染synoviolin48h后增殖能力顯著增強(P<0.01)。流式細胞術(shù)檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)，G1期細胞比例小于對照(P<0.05)，S期細胞比例顯著高于對照(P<0.01)，細胞增殖指數(shù)高于對照(P<0.05)，提示過表達synoviolin對滑膜細胞有促進增殖的作用。
　　 3.2.4.過表達synoviolin促進滑膜細胞

12、HA分泌增加
　　 為了檢測synoviolin對滑膜細胞HA分泌能力的影響，我們使用兔透明質(zhì)酸ELISA試劑盒對感染Lenti-synoviolin的滑膜細胞進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒感染滑膜細胞后，細胞上清HA含量均有顯著升高，其中24h和48h(P<0.05)，72h(P<0.01)。提示過表達synoviolin有促進滑膜細胞分泌HA的作用。
　　 3.3.synoviolin促進功能性滑膜形成的作用
　　

13、 3.3.1.過表達synoviolin促進滑膜的形成
　　 滑膜細胞感染Lenti-synoviolin或Lenti-lacZ后，分別與無滑膜肌腱體外共培養(yǎng)3天和7天后，HE染色和掃描電鏡觀察到肌腱表面可見細胞附著生長并形成細胞層。通過對肌腱表面的細胞計數(shù)，結(jié)果顯示，過表達synoviolin組肌腱表面滑膜細胞數(shù)量明顯高于對照組，提示過表達synoviolin能加速滑膜的形成
　　 3.3.2.共培養(yǎng)肌腱具有分泌HA

14、的功能
　　 滑膜細胞與無滑膜肌腱共培養(yǎng)3天后阿辛藍染色觀察發(fā)現(xiàn)，Lenti-synoviolin和Lenti-lacZ組在0.06 M MgCl2濃度時染色均呈陽性，而在MgCl2濃度為1，2.61，3.56時，兩組染色均呈陰性。這個現(xiàn)象說明肌腱表面有細胞合成的酸性粘多糖(透明質(zhì)酸)存在，提示共培養(yǎng)肌腱具有分泌HA的功能。
　　 4.結(jié)論
　　 4.1.過表達synoviolin促進滑膜細胞的增殖；