端粒異常和圓錐角膜發(fā)病關(guān)系的研究.pdf

1、目的 圓錐角膜是一種局限性的角膜圓錐樣突起并伴有突起區(qū)角膜基質(zhì)變薄的疾病，發(fā)病率約達(dá)1/2000，它對青少年的視力危害較大。曾有學(xué)者發(fā)現(xiàn)圓錐角膜的發(fā)生與先天發(fā)育異?；蚴沁z傳有關(guān)且或伴隨Down綜合征或Leber’s先天性黑朦癥，但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)在其發(fā)生過程中還存在著膠原異常及細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，并存在有與器官的早老過程相似的現(xiàn)象。為證實細(xì)胞衰老在圓錐角膜發(fā)病中可能發(fā)揮的作用，本研究對圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)端粒長度的變化以及圓錐角

2、膜基質(zhì)內(nèi)衰老標(biāo)記蛋白-30(senescence marker protein-30，SMP-30)和衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶(SA-beta-galactosidase)的表達(dá)進(jìn)行了檢測，以探討這些分子標(biāo)志物在圓錐角膜發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。 方法 一、實驗材料 病變組收集2006年1月至12月間于山東省眼科研究所青島眼科醫(yī)院接受角膜移植治療的圓錐角膜患者(32人)的病變角膜37份，其中男性(25人)標(biāo)本29份，

3、女性(7人)標(biāo)本8份，患者年齡13～34歲，平均19.4±4.7歲，標(biāo)本獲取后均立即置于-80℃超低溫冰箱貯存。正常對照組標(biāo)本為青島眼科醫(yī)院眼庫中供臨床上穿透性角膜移植術(shù)后剩余的供體角膜組織，共20份，供體年齡9～25歲，平均19.2±4.4歲，標(biāo)本也置于-80℃超低溫冰箱保存。 二、Southern Blot雜交檢測端粒長度(一)、總DNA的提取光學(xué)顯微鏡下機(jī)械法刮除角膜標(biāo)本的上皮及內(nèi)皮，應(yīng)用DNA提取試劑盒分別提取21份病變

4、角膜及12份正常角膜標(biāo)本基質(zhì)細(xì)胞的總DNA，檢測總DNA濃度確定適用。 (二)、Southern Blot雜交技術(shù)檢測病變角膜基質(zhì)細(xì)胞和正常角膜基質(zhì)細(xì)胞的端粒長度1、酶切基因組DNA等比配制內(nèi)切酶Hinf Ⅰ-Rsa Ⅰ混合物，使每種內(nèi)切酶的濃度為20U/μl。配制20μl的樣本DNA反應(yīng)體系：取樣本DNA至微離心管內(nèi)使每份樣品DNA含量達(dá)到1μl，加入無核酸酶水使每個樣本均稀釋到17μl后，每樣本加入2μl10×digesti

5、onbuffcr及1μl內(nèi)切酶混合物(含內(nèi)切酶Hinf Ⅰ-Rsa Ⅰ各20U/μl)，混勻，37℃孵育3h。 2、瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段加入4μl 5×loading buffer于酶切后的樣本中，將樣本及DIG molecular weightmarker分別加入0.8％瓊脂糖凝膠電泳泳道，12V/cm恒壓電泳約1.5h。 3、轉(zhuǎn)膜印記 制備轉(zhuǎn)膜三明治(濾紙-尼龍膜-瓊脂糖凝膠-濾紙)，于半干轉(zhuǎn)膜儀中0

6、.5mA/cm<'2>恒流轉(zhuǎn)膜10min。 4、雜交及化學(xué)發(fā)光的檢測將尼龍膜浸入15ml 42℃預(yù)熱后的預(yù)雜交液中，42℃預(yù)雜交1h后，棄去預(yù)雜交液。加入5ml含端粒探針(濃度)的雜交液，42℃雜交3h。分別用不同濃度的洗液洗尼龍膜，以地高辛堿性磷酸酶抗體孵育后結(jié)合化學(xué)發(fā)光底物。暗室內(nèi)X-ray膠片曝光檢測化學(xué)發(fā)光。 三、老化標(biāo)記物的檢測(一)檢測衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶(SA-beta-galactosidase)的表

7、達(dá)分別將病變角膜和正常角膜基質(zhì)常規(guī)制作石蠟切片，將切片進(jìn)行脫蠟水化處理。處理后的切片加入細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色試劑盒中的β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫反應(yīng)15min，0.02M PBS室溫洗滌3次，每次5min，同時按照試劑盒說明書配制染色工作液(10μl β-半乳糖苷酶染色液A，10μl β-半乳糖苷酶染色液B，930μl β-半乳糖苷酶染色液C，50μl X-gal溶液)，染色工作液浸泡切片37℃~育24～30h。

8、(二)RT-PCR法檢測SMP-30的表達(dá)分別提取圓錐角膜及正常角膜基質(zhì)細(xì)胞的總mRNA，通過RT-PCR對角膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)SMP-30的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測。PCR所用引物根據(jù)人的SMP-30mRNA序列，使用primer 3軟件進(jìn)行設(shè)計，序列如下：上游5'ccg tgg atg cct ttg actat 3'，下游5'caa ctt cat gC tgct ttg ga 3'；PCR產(chǎn)物片段大小為233bp。四、組織學(xué)觀察常規(guī)制

9、作病變和正常角膜的石蠟切片，采用蘇木素-伊紅(HE)染色并于光學(xué)顯微鏡下觀察病變角膜和正常角膜基質(zhì)的組織學(xué)及基質(zhì)細(xì)胞密度的變化。 結(jié)果 1、圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞的端粒長度為10.29～14.12kb，平均端粒長度為11.54±1.41 kb；正常角膜基質(zhì)細(xì)胞的端粒長度為12.64～15.32 kb，平均端粒長度為13.45±0.99 kb；統(tǒng)計學(xué)分析顯示兩者差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞的端粒

10、長度短于正常角膜基質(zhì)細(xì)胞。 2、組織學(xué)觀察顯示正常角膜基質(zhì)纖維排列規(guī)則緊密，而圓錐角膜基質(zhì)膠原纖維排列呈現(xiàn)疏松不規(guī)則；正常角膜基質(zhì)內(nèi)的角膜細(xì)胞規(guī)則地分布在基質(zhì)中，但圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞分布較前者散亂且數(shù)量減少。 3、組織化學(xué)染色揭示圓錐角膜基質(zhì)內(nèi)X-gal染色可見散在分布藍(lán)色陽性著色，表明存在衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶的表達(dá)；而正常角膜基質(zhì)中X-gal染色陰性，未見衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶表達(dá)。RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)圓錐角膜