不同金屬離子誘導枸杞體細胞胚發(fā)生及枸杞多倍體培育研究.pdf

1、植物體細胞胚發(fā)生的機理研究和多倍體誘導的技術優(yōu)化一直是植物分子及細胞生物學中的兩個熱點問題。已有的研究表明，不同價位金屬離子分別對寧夏枸杞(Lycium barbarum L．)體細胞胚發(fā)生的調(diào)節(jié)效應和作用機制差異顯著，但在同一條件下的比較試驗嚴重不足，且以體細胞胚為基底的同源四倍體誘導非常少見。本研究以寧夏枸杞代表品種一寧紅1號為試驗材料，以不同價位的金屬離子Ag+、Ca2+和Eu3+的可溶性化合物按照不同濃度梯度作為外源影響因子，試

2、驗研究了三種不同外植體根基部、莖和葉切塊體細胞胚發(fā)生的效率和相對生長速率；同時試驗比較了體細胞胚、愈傷組織和激活種子在不同濃度梯度的秋水仙素和DMSO混合液誘導下枸杞同源四倍體發(fā)生效率，并對育成的同源四倍體進行了細胞學和形態(tài)學分析。以上兩個方面為今后枸杞體細胞胚誘導的高效體系的建立和植物同源多倍體技術優(yōu)化提供理論基礎，為將來名貴中藥材高效同質(zhì)多倍體的培育、減少或避免嵌合體干擾的產(chǎn)生、提高誘變效率提供實踐途徑。主要試驗結果如下：

3、1.枸杞無菌苗長至3-4片真葉后，將根基部、莖和葉切成小塊，在MS+2，4-D0.2mg/L的誘導培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導，發(fā)現(xiàn)真葉被誘導得到的胚性愈傷組織長勢最好、相對生長速率最高，轉入無激素MS培養(yǎng)基時得到的體細胞胚數(shù)最多。葉愈傷組織比起根基部和莖被誘導得到的愈傷組織質(zhì)地緊密，相對生長速率達到0.04g/(d·外植體)、而根基部和莖的都是0.02g/(d·外植體)；轉入無激素MS培養(yǎng)基15天時，每塊胚性愈傷組織所誘導的體細胞胚數(shù)分別

4、是根39.1個、莖42.8個、葉44.9個。 2.根基部、莖和葉為外植體誘導得到的愈傷組織在含2，4-D 0.2mg/L的MS培養(yǎng)基上4次繼代培養(yǎng)后，轉入含不同濃度梯度的Ag+、Ca2+和Eu3+三種外源離子的MS培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)三種離子在低濃度情況下均可促進愈傷組織的體細胞胚發(fā)生，而高濃度抑制體細胞胚的形成，且體細胞胚數(shù)在三種外植體中具有相同的變化趨勢。當Ag+濃度為1mg/L時，每塊葉愈傷組織形成的體細胞胚數(shù)為對照組

5、的2倍多，Ca2+和Eu3+在其較適宜濃度下均無達到這個水平。 3.枸杞多倍體誘導： 愈傷組織：枸杞無菌苗葉片在MS+0.1mg/L6BA+0.5mg/LNAA激素條件下誘導出來的無綠色芽點、質(zhì)地緊密的愈傷組織為試驗材料，在0.2％秋水仙素和2％DMSO混合液處理48h時誘導率高達66.7％，且嵌合體少、同質(zhì)性高，是較好的枸杞多倍體誘導的方法。 激活種子：將枸杞種子經(jīng)常規(guī)消毒后浸于無菌水中，待種子露白時用0.2％

6、秋水仙素和2％DMSO混合液浸泡24h時誘導率最高達8％，但嵌合體現(xiàn)象嚴重，多倍體的特征不穩(wěn)定，表現(xiàn)出不同程度的回復突變。 體細胞胚：枸杞無菌苗葉片在含0.2mg/L2，4-D的MS培養(yǎng)基上誘導出來的愈傷組織在相同培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)4次后，轉入不含激素的MS培養(yǎng)基上分化10天所得到的球形胚為試驗材料，在20mg/L秋水仙素和1％DMSO混合液處理24h時誘變率6％、無嵌合體現(xiàn)象。本文首次報道，在體細胞胚的離體條件下，通過秋水仙素處

7、理誘導獲得了枸杞同源四倍體。 4.染色體計數(shù)鑒定表明，正常二倍體植株染色體數(shù)為24，所得到的四倍體植株染色體增加一倍，為48條染色體。 5.從形態(tài)學和細胞學方面對四倍體植株和二倍體植株進行了比較。結果顯示，形態(tài)上四倍體比二倍體植株根系較少，但粗壯。四倍體植株與二倍體植株在氣孔大小、頻度具極顯著差異。在40倍鏡下，四倍體氣孔長度31.9μm，二倍體植株氣孔長度24.3μm；四倍體寬度29.0μm，二倍體寬度23.9μm。而在10倍