胃十二指腸疾病高發(fā)區(qū)幽門螺桿菌毒力分析及dupA(2499)基因功能研究.pdf

1、目的:
　　幽門螺桿菌（H.pylori)是定植于人類胃粘膜上皮細胞表面的一種細菌，與胃十二指腸疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關。分析胃十二指腸疾病高發(fā)區(qū)（威海）H.pylori臨床分離株毒力因子的分子特征（包括cagPAI、vacA基因和dupA基因），以評價該地區(qū)H.pylori臨床分離株的毒力。研究該地區(qū)H.pylori菌株的dupA基因功能，以探討H.pyloridupA基因的致病機制。
　　方法:
　　1.選取胃十二

2、指腸疾病高發(fā)區(qū)（威海）臨床就診的患者，進行胃粘膜組織分離培養(yǎng)H.pylori菌株。采用PCR擴增結合測序的方法，分析H.pylori臨床分離株cagPAI（cagA，cagE,cagI,cagL,cagM,cagT和cagX基因）、cagA基因3'端可變區(qū)、vacA基因和dupA基因類型，與NCBI(NationalCenterofBiotechnologyInformation)中相關序列進行比對。并根據基因序列獲得了相應蛋白的氨基酸

3、序列，采用MEGA4.1構建相應系統(tǒng)發(fā)育樹。
　　2.研究分離于十二指腸潰瘍患者的H.pyloriWH-21菌株攜帶的dupA基因類型，并對其蛋白進行生物學信息學分析，包括該蛋白一級結構、二級結構和三級結構特征及該蛋白細胞定位和功能結構域等。
　　3.構建pET-32a-dupA原核表達載體，轉化于E.coliRosetta(DE3)中。經IPTG誘導后表達重組DupA蛋白，以Ni2+-NTA珠分離純化目的蛋白。利用ATPa

4、se分解ATP生成無機磷的原理，檢測重組DupA蛋白的ATPase活性。采用動物實驗制備抗重組DupA蛋白多克隆抗血清。
　　4.利用Westernblotting法檢測DupA(2499)蛋白的亞細胞定位。采用免疫共沉淀實驗和質譜分析方法，進行DupA(2499)蛋白的互作蛋白分析。
　　5.構建敲除載體pBluescript/△dupA∷KMr，采用同源重組的方法構建H.pyloridupA(2499)基因缺失株。

5、>　　6.H.pylori和GES-1細胞共培養(yǎng)后，采用Westernblotting方法分析dupA(2499)基因的缺失對H.pyloriCagA蛋白轉運的影響，以及CFU實驗和粘附率實驗分析H.pyloridupA(2499)基因缺失株的粘附功能。
　　7.分析不同pH值液體培養(yǎng)基中H.pylori生長情況，研究H.pyloridupA(2499)基因缺失株對酸性環(huán)境的抵抗力。采用Westernblotting，分析培養(yǎng)后上

6、清液中脲酶含量。H.pylori和GES-1細胞共培養(yǎng)，采用ELISA方法分析上清液中IL-8的濃度，分析H.pyloridupA(2499)基因缺失株毒力變化。
　　8.H.pylori和MKN-45細胞共培養(yǎng)后，采用MTT方法檢測H.pyloridupA(2499)基因缺失株的細胞毒變化，Hoechst33258染色后顯微鏡下觀察H.pyloridupA(2499)基因缺失株對腫瘤細胞形態(tài)變化的影響，Westernblotti

7、ng分析線粒體通路的凋亡相關分子標志變化，包括活化Caspase-3，PARP，Bax和Bcl-2變化。
　　結果:
　　1.經過PCR擴增后，116株H.pylori臨床分離株均攜帶cagA，cagL，cagM,cagT和cagX基因，而只有89.7％(104/116)和82.8％(96/116)菌株分別擴增出cagE和cagI基因。25.9％(30/116)菌株中發(fā)現cagPAI部分缺失，其中cagPAI部分缺失株在慢性

8、胃炎中占44.4％(24/54)顯著高于胃潰瘍、十二指腸潰瘍和胃癌(9.7％，6/62)(p＜0.001)。未發(fā)現cagPAI完全缺失的H.pylori菌株。
　　24株菌株cagA3'端可變區(qū)氨基酸序列可分為兩大群:東亞型(91.7％)和西方型(8.3％)，其中前者為EPIYA-A-B-D型，后者為EPIYA-A-B-C型。CagPAI蛋白中除了CagL蛋白外，CagI、CagM、CagT和CagX蛋白序列均為保守。系統(tǒng)發(fā)育樹提

9、示CagPAI蛋白也分為兩個群:東亞型和西方型，大部分菌株也屬于東亞型。
　　H.pylori臨床分離株vacA基因s區(qū)和m區(qū)的主要流行模式為s1a/m2(48.3％)和s1c/m2(13.8％)。31.0％的H.pylori臨床分離株攜帶dupA基因，其中在胃潰瘍、十二指腸潰瘍和胃癌攜帶率為40.3％，高于慢性胃炎(20.4％，p=0.02)。dupA基因序列分析顯示其讀碼框架為2499bp，稱作dupA(2499)基因。

10、>　　2.H.pyloriWH-21菌株攜帶的dupA基因全長2499bp，稱作dupA(2499)基因。威海地區(qū)8株dupA堿基序列同源性為99.3％，與日本兩株H.pylori菌株的dupA基因堿基序列同源性為99.25％，不同地區(qū)14株H.pyloridupA堿基序列同源性為91.65％。生物信息學分析發(fā)現DupA(2499)蛋白為穩(wěn)定親水性蛋白質，抗原性強。無信號肽且有多個跨膜區(qū)，定位于細胞內膜。α螺旋是該蛋白多肽鏈中主要組成結

11、構元件，具有一個卷曲螺旋結構。三維結構預測其配體結合物質為ADP、ATP和Mg2+等。與CagE_TrbE_VirB超家族有較高的同源性，具有ATP結合位點。
　　3.獲得了重組DupA蛋白，該蛋白ATPase活力為129.5±17.8U/mgprot。成功制備了抗重組DupA蛋白多克隆抗血清，抗體效價為1∶6.4×104。
　　4.Westernblotting結果顯示DupA(2499)蛋白定位于胞膜。經過免疫共沉淀實驗

12、和質譜分析，DupA(2499)蛋白的互作蛋白為脲酶和HSP60。
　　5.獲得了H.pyloridupA(2499)基因缺失株，并通過了PCR和Westernblotting的驗證。
　　6.采用H.pylori感染GES-1細胞后，缺失株組和野生株組向胞內轉運CagA蛋白無差別。CFU實驗結果[（27.2±7.1）×106和(28.5±6.9)×106，p=0.772]和粘附率實驗結果（81.0％和78.8％，p=0.7

13、24）均無明顯差異。
　　7.除pH6.5～pH7.5之外，其它酸性環(huán)境下野生株組菌量顯著高于缺失株組(p＜0.05)。缺失株組的脲酶分泌低于野生株組，特別在酸性環(huán)境時。細菌細胞共培養(yǎng)后，野生株組上清液中IL-8濃度顯著高于缺失株組(p＜0.001)。
　　8.與對照組比較，細菌細胞共培養(yǎng)12h后MKN-45細胞存活率開始降低，缺失株組MKN-45細胞存活率顯著高于野生株組(p＜0.05)。細菌細胞共培養(yǎng)12h后，Hoech

14、st33258染色結果顯示缺失株組和野生株組均可以引起MKN-45細胞凋亡，但野生株組凋亡率顯著高于缺失株組(p＜0.05)。6h后野生株組和缺失株組均開始出現Caspase-3和PARP的剪切活化，野生株組強于缺失株組。與缺失株組比較，野生株組Bax明顯上調而Bcl-2則明顯下調。
　　結論:
　　1.胃十二指腸疾病高發(fā)區(qū)（威海）H.pylori臨床分離株為強毒株，與該地區(qū)的胃十二指腸疾病高發(fā)相關。H.pylori強毒性特

15、征與東亞型cagA基因3'端可變區(qū)、完整的cagPAI、東亞型cagPAI基因、強毒性vacA基因和dupA(2499)基因有關。
　　2.dupA(2499)基因保守且同源性高，適宜進行體外表達。DupA(2499)蛋白穩(wěn)定且抗原性強，適合抗體的制備。
　　3.DupA(2499)蛋白獨立于CagPAI之外，存在于H.pylori的內膜，具有ATPase活性并參與脲酶的分泌，但不參與H.pylori的CagA蛋白的轉運和其