胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩的成像研究-共聚焦成像記錄法的建立及鈣振蕩基本特點分析.pdf

1、背景與目的：
　　胞內(nèi)鈣信號與很多生理過程密切相關(guān)。胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩是胞內(nèi)鈣信號的一種典型表現(xiàn)形式,為胞內(nèi)鈣信號研究的常用模型,與胰液的分泌和胰腺炎的發(fā)病機(jī)制有密切關(guān)系。本研究根據(jù)課題組的現(xiàn)有條件,參考有關(guān)文獻(xiàn),在合作研究組(美國Barrow神經(jīng)學(xué)研究所吳杰教授研究組)的幫助下,利用激光共聚焦顯微鏡(laser confocal microscope)和微量灌流給藥系統(tǒng),成功建立了乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)誘

2、發(fā)的胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩(calcium oscillations in pancreatic acinar cells)的成像研究方法。以此為基礎(chǔ),本研究進(jìn)一步探討了Ach誘發(fā)的胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)特點、去敏感化現(xiàn)象和劑量效應(yīng),另外也觀察了咖啡因(caffeine,Caf)對胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩的影響,以更深入系統(tǒng)地了解鈣振蕩的特征和相關(guān)機(jī)制。
　　材料與方法：
　　選用3-4周的成年昆明小鼠,雌雄不限;麻醉處死后,打

3、開腹腔,取出胰臟;用膠原酶消化7-8分鐘,取上清,機(jī)械吹打,離心2次,去上清,加適量標(biāo)準(zhǔn)液成胰腺腺泡細(xì)胞液;用移液槍取適量腺泡細(xì)胞液于培養(yǎng)皿中,fluo4-AM染色,Ach等藥物通過微量灌流系統(tǒng)按一定的時間次序作用于細(xì)胞上,利用激光共聚焦顯微鏡實時記錄此過程中的胞內(nèi)鈣信號變化。實驗所獲得的圖像數(shù)據(jù)經(jīng)綜合使用多種軟件處理后,可獲得各個有效細(xì)胞的平均鈣釋放量、鈣振蕩頻率、鈣振蕩延時等參數(shù);最后對所得參數(shù)分組進(jìn)行統(tǒng)計分析,以明確鈣振蕩的基本特

4、點。
　　結(jié)果：與結(jié)論：
　　1.在我們的實驗系統(tǒng)中,Ach(400nM)可較穩(wěn)定地引起胰腺腺泡細(xì)胞產(chǎn)生鈣振蕩:平均鈣釋放量為1.41±0.02(F/F0),鈣振蕩頻率為0.053±0.001Hz,n=99。該反應(yīng)可被阿托品(1μM)完全阻斷。此結(jié)果表明我們已成功建成胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩的成像研究方法,而且我們觀察到的鈣振蕩是通過M受體起作用的。
　　2.乙酰膽堿(Ach)的去敏感化分析:對于同一細(xì)胞,先加入一定濃度的A

5、ch(400nM)可引起一定幅度和頻率的鈣振蕩,間隔一定時間后,再加入相同濃度的Ach,可發(fā)現(xiàn)鈣振蕩幅度和頻率均有所降低:后一反應(yīng)的平均鈣釋放量約為前面反應(yīng)的91％±1%,鈣振蕩頻率為95%±1%,n=19。
　　3.Ach的劑量效應(yīng):在一定濃度范圍內(nèi)(50nM~1600nM),鈣振蕩從無到有,平均鈣釋放量從弱到強(qiáng),鈣振蕩頻率從低到高(當(dāng)濃度足夠高如1600nM時,胞內(nèi)鈣信號維持在一個較高水平而不再振蕩),呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。其中

6、,Ach(400nM)可較穩(wěn)定地誘發(fā)出典型的鈣振蕩。
　　4.咖啡因(caffeine)的影響:我們測試了多個濃度Caf的效應(yīng),發(fā)現(xiàn)在測試過的175個細(xì)胞中,有23個細(xì)胞(占13.1%)在加1mM的Caf后鈣振蕩完全消失,另外152個細(xì)胞的鈣振蕩減弱:平均鈣振蕩幅度減小,頻率降低。而在有鈣振蕩的例數(shù)中,Caf(n=152)可使胰腺腺泡細(xì)胞的平均鈣釋放量減少約1.6%,鈣振蕩頻率減少約2.7%。發(fā)現(xiàn)在測試過的91個細(xì)胞中,有25個細(xì)

7、胞(占27.5%)在加5mM的Caf后鈣振蕩完全消失,另外66個細(xì)胞的鈣振蕩減弱:平均鈣振蕩幅度減小,頻率降低。而在有鈣振蕩的例數(shù)中,Caf(n=66)可使胰腺腺泡細(xì)胞的平均鈣釋放量減少約3.7%,鈣振蕩頻率減少約3.6%。可見一定濃度的Caf可明顯減弱胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩。而加入10mM和20mMCaf后鈣振蕩完全消失。
　　以上結(jié)果表明:借助激光共聚焦顯微鏡可直觀實時穩(wěn)定地觀察到Ach所誘發(fā)的胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩,該鈣振蕩是通過M