SOCs激動劑-抑制劑對正常-缺血再灌注損傷大鼠肝細(xì)胞鈣振蕩的影響.pdf

1、目的：建立適用于鈣成像記錄技術(shù)的Sprague-Dawley(SD)大鼠正常和缺血再灌注損傷肝細(xì)胞的急性分離方法，利用鈣成像技術(shù)研究鈣池調(diào)控鈣離子通道(store-operated channels，SOCs)在SOCs激動劑(去甲腎上腺素、ATP和后葉加壓素)誘導(dǎo)的正常和缺血再灌注損傷肝細(xì)胞鈣振蕩過程中的作用。觀察SOCs抑制劑(粉防己堿、U73122、尼氟滅酸)對正常和缺血再灌注損傷肝細(xì)胞鈣振蕩頻率的影響；以期探討生理和病理條件下肝

2、細(xì)胞鈣振蕩過程中SOCs的改變及藥物影響。同時，探討花生四烯酸(non-selective cation channels(NSCCs)激動劑)對正常肝細(xì)胞鈣振蕩頻率的影響，以期了解NSCCs是否參與肝細(xì)胞鈣振蕩. 方法：以SD大鼠為實驗動物，通過門靜脈插管循環(huán)灌流IV型膠原酶原位兩步灌注法急性分離正常和缺血再灌注損傷肝細(xì)胞。使用Fluo-4-AM標(biāo)記胞內(nèi)鈣離子，應(yīng)用SOCs激動劑(去甲腎上腺素、ATP和后時加壓素)誘發(fā)肝細(xì)胞鈣

3、振蕩，應(yīng)用鈣成像技術(shù)測定正常和缺血再灌注損傷肝細(xì)胞內(nèi)鈣振蕩的特性。應(yīng)用SOCs激動劑誘發(fā)正常和缺血再灌注損傷肝細(xì)胞產(chǎn)生鈣振蕩，分別加入SOCs抑制劑(粉防己堿、U73122和尼氟滅酸)觀察其對鈣振蕩的影響。觀察花生四烯酸(NSCCs激動劑)對正常肝細(xì)胞鈣振蕩頻率的影響。 結(jié)果：通過大鼠正常/缺斑再灌注損傷肝細(xì)胞分離方法，獲得的肝細(xì)胞純度和成活率可達(dá)85％，適用于鈣成像實驗。SOCs激動劑去甲腎上腺素(100 nM)，ATP(1.

4、2肛M)和后葉加壓素(0.5 nM)能夠誘發(fā)正常肝細(xì)胞產(chǎn)生鈣振蕩。然而，對缺血再灌注肝細(xì)胞的研究表明，上述激素誘發(fā)產(chǎn)生鈣振蕩所需的濃度比正常組低，分別為去甲腎上腺素(10 nM)，ATP(0.6μM)和后葉加壓素(0.1nM)。SOCs抑制劑粉防已堿(100μM)、U73122(25μM)和尼氟滅酸(20μM)能夠完全抑制由SOCs激動劑去甲腎上腺素、ATP、后葉加壓素在正常/缺血再灌注損傷肝細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)的鈣振蕩，抑制作用起效時間短，且它

5、們的抑制作用均為可逆性。粉防己堿對于正常/缺血再灌注損傷肝細(xì)胞鈣振蕩的頻率均有抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性。應(yīng)用去甲腎上腺素(100 nM)誘發(fā)鈣振蕩的IC5o分別為：31.754μM(正常肝細(xì)胞)、45.994μM(缺血再灌注肝細(xì)胞)。應(yīng)用去甲腎上腺素(10nM)誘發(fā)鈣振蕩組的IC50為26.458μM(缺血再灌注肝細(xì)胞)。 結(jié)論：本實驗成功建立了適用于鈣成像技術(shù)的SD大鼠正常和缺血再灌注損傷肝細(xì)胞的急性分離方法。S

6、OCs激動劑后葉加壓素、ATP、去甲腎上腺素可以誘導(dǎo)急性分離的正常/缺血再灌注肝細(xì)胞產(chǎn)生規(guī)律性鈣振蕩，并且這種規(guī)律性的鈣振蕩可能需要外鈣通過SOCs內(nèi)流來維持?；ㄉ南┧岵患せ罴毙苑蛛x肝細(xì)胞膜上的NSCCs，相反它會抑制鈣振蕩，提示NSCCs并不參與維持肝細(xì)胞的鈣振蕩。本實驗發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷會增加肝細(xì)胞產(chǎn)生鈣振蕩的敏感性，推測可能與肝臟缺血再灌注損傷誘發(fā)的SOCs特性改變有關(guān)。前人的實驗提示粉防己堿(磷脂酶A2抑制劑)、U73122(