胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩及其與急性胰腺炎動物模型的關(guān)系初探.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　本研究的目的有三:1、在實(shí)驗(yàn)室已有工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步完善小鼠胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩（Pancreatic Acinar Cell Calcium Oscillations, PACCOs）的激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM）成像研究方法,對PACCOs進(jìn)行較系統(tǒng)的觀測；2、構(gòu)建小鼠胰腺腺泡細(xì)胞的急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP

2、）模型和小鼠的AP整體動物模型,分別觀測其 PACCOs的特點(diǎn)；3、以此為基礎(chǔ),探討大麻素受體激動劑GW405833（GW）對小鼠PACCOs和AP模型的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.小鼠胰腺腺泡細(xì)胞的急性分離:選用4~6個月（40~60 g）的昆明小鼠，經(jīng)麻醉、頸椎脫臼處死后迅速取其胰腺，以膠原酶消化的方法獲取胰腺腺泡細(xì)胞懸液。
　　2. PACCOs的LSCM成像記錄:取適量胰腺腺泡細(xì)胞懸液于標(biāo)本槽中，待細(xì)胞貼壁

3、后，避光負(fù)載鈣熒光染料Fluo-4-AM，以乙酰膽堿（ACh）誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞產(chǎn)生鈣振蕩；相關(guān)藥物的影響根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案的要求適時通過灌流系統(tǒng)給予；以連續(xù)二維掃描的方式（XYT）進(jìn)行LSCM成像記錄；掃描記錄覆蓋加藥前、加藥中和藥物沖洗后的全過程。實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。
　　3.小鼠整體和離體AP模型的制備和測試：（1）整體模型：取4~6個月的昆明小鼠，按體重分兩次（間隔1 h）腹腔注射左旋精氨酸（L-Arg,4 g/kg）制備AP動物模

4、型，分別在第二次注射后的24 h，采集血樣、右肺和胰尾組織分別用于測試血清淀粉酶（AMS）、肺組織髓過氧化物酶（MPO）活性和胰腺組織病理切片,急性分離的胰腺腺泡細(xì)胞則用于鈣振蕩的成像記錄。GW（10 mg/kg）(在有需要的情況下)則在建模前0.5h按體重腹腔注射。（2）離體模型：在急性分離的細(xì)胞中按不同方案直接加入L-Arg，對其鈣振蕩進(jìn)行LSCM成像觀察。
　　4.數(shù)據(jù)的分析處理：綜合應(yīng)用 Olympus Fluoview（

5、共聚焦顯微鏡自帶的軟件）、ImageJ（美國NIH開發(fā)的免費(fèi)圖像軟件）和Excel VBA編程的方法實(shí)現(xiàn)對圖像數(shù)據(jù)的有效處理和統(tǒng)計(jì)分析。反映鈣振蕩特點(diǎn)的主要參數(shù)是平均鈣釋放量。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以自身對照為主，多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論：
　　1.成年小鼠PACCOs的LSCM成像研究：采用LSCM的XYT掃描方式可直觀而方便地記錄到ACh誘發(fā)的急性分離的小鼠PACCOs，該反應(yīng)可被

6、毒蕈堿型受體（M受體）阻斷劑阿托品完全阻斷。以此為基礎(chǔ)，本研究進(jìn)一步優(yōu)化了灌流系統(tǒng)，提高了動物的選用標(biāo)準(zhǔn)，通過劑量效應(yīng)確定了ACh的常用濃度為100 nM；在此基礎(chǔ)上，觀察比較了同一視野下不同細(xì)胞以及同一細(xì)胞內(nèi)不同部位的鈣振蕩特點(diǎn)，以期更全面認(rèn)識胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩；盡可能采用兩段式的自身對照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以期避開激光照射損傷和染料毒性的影響，使PACCOs的成像研究更可靠。
　　2. L-Arg和GW對急性分離胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩的

7、影響：與對照組相比，一定時間（5~10 min）的L-Arg10 mM孵育可使PACCO的平均鈣釋放強(qiáng)度增大（n5 min=103, P≤0.05；n10 min=136, P＜0.01）；但孵育20 min后則使其減弱（n=80, P＜0.05），這與AP時腺泡細(xì)胞胞內(nèi)鈣信號的變化情況類似。GW則對PACCOs有明顯的抑制作用（nGW50μM=99, P＜0.01；nGW100μM=66, P＜0.01）。用GW與L-Arg共同孵育細(xì)

8、胞時，發(fā)現(xiàn)GW可逆轉(zhuǎn)L-Arg孵育造成的PACCOs平均鈣釋放量的增高，使PACCOs的平均鈣釋放量恢復(fù)到對照組的水平（n=108, P＜0.01）。
　　3. AP動物模型的研究：在用腹腔大劑量注射兩次L-Arg（4 g/kg），兩次間隔1 h的方法誘導(dǎo)的AP模型中，24 h內(nèi)動物死亡率約為60％，PACCOs的平均鈣釋放量在24 h時明顯增強(qiáng)（約增強(qiáng)25.76%， n=80, P＜0.01），48 h時則減弱（約降低13.04

9、%，n=124, P＜0.05）；預(yù)先用GW處理動物后再造模，24 h內(nèi)動物死亡率約為40%， AP24 h時 PACCO的平均鈣釋放量恢復(fù)到了對照組的水平（n=177, P＞0.05）。AP時，血清AMS和肺組織MPO活性在24 h時顯著升高（nAMS=4, P<0.05,升高63.5%；nMPO=3, P<0.05,升高25.2%），胰腺組織發(fā)生輕微病理改變；而預(yù)先用GW處理動物后再造模，血清 AMS和肺組織 MPO活性與對照組的差