蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶家族不可逆苯并咪唑噻唑衍生物抑制劑的發(fā)現(xiàn).pdf

1、研究背景
　　蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化修飾是真核細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種重要調(diào)控，動(dòng)態(tài)可逆的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化程度由蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(PTK)和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTP)協(xié)同調(diào)控。PTP在許多生理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，調(diào)控細(xì)胞的增殖分化、遷移、細(xì)胞內(nèi)代謝、免疫應(yīng)答和神經(jīng)活動(dòng)等。異常的PTP活力可能引發(fā)多種人類疾病，如癌癥或者糖尿病。PTP1B在胰島素信號(hào)通路中起負(fù)調(diào)控作用，其活性異常與糖尿病發(fā)生有關(guān)。YopH是耶爾森菌逃避宿主先天免疫應(yīng)答的

2、重要因子;紋狀體富集蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(Striatal enriched tyrosine phosphatases，STEP)作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)特有的磷酸酶，對(duì)突觸的可塑性、神經(jīng)元的生存等具有重要調(diào)節(jié)作用。STEP功能失調(diào)有可能導(dǎo)致包括阿爾茲海默癥在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性性疾病。目前，PTP作為潛在的藥物靶標(biāo)日益引起關(guān)注。特異性調(diào)控PTP的小分子化合物不僅是應(yīng)用于開發(fā)臨床藥物的希望所在，也可作為特定的活性探針來(lái)研究并闡明PTP在細(xì)

3、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮的重要作用。因此發(fā)展高效的小分子探針并深入研究其作用機(jī)制具有重要意義。
　　研究目的
　　通過(guò)獲得純化的STEP、LYP、PTP1B、YopH和MEG2蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶進(jìn)行酶學(xué)分析及小分子抑制劑活性篩選的研究。
　　材料與方法
　　將STEP、LYP、PTP1B、YopH和MEG2蛋白磷酸酶野生型序列亞克隆到pET-15b、pET-28a和pET-22b等表達(dá)載體上，隨后轉(zhuǎn)化至E.coli B

4、L21工程菌中表達(dá)，通過(guò)親和層析和凝膠阻滯層析等技術(shù)，獲得純化的STEP、LYP等磷酸酶，并以pNPP為底物對(duì)其進(jìn)行體外酶活測(cè)定，并運(yùn)用連續(xù)讀數(shù)法、IC50半抑制效率測(cè)定法、抑制劑酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定進(jìn)行抑制劑篩選，隨后通過(guò)測(cè)定抑制劑對(duì)其他磷酸酶PPM家族的選擇性揭示化合物是否具有特異性，確定化合物的作用。
　　結(jié)果
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明STEP、YopH、MEG2等磷酸酶蛋白表達(dá)成功，并可經(jīng)純化活動(dòng)純度超過(guò)90％的酶用于體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)。

5、純化后的STEP、YopH、MEG2等磷酸酶SDS-PAGE電泳表觀分子量分別為35 kDa、33 kDa、38 kDa等。隨后，根據(jù)對(duì)STEP等磷酸酶基本酶活分析，又從化合物庫(kù)中篩選出1種具明顯抑制作用且結(jié)構(gòu)新穎的抑制劑，小分子化合物E4以時(shí)間和濃度依賴性的方式抑制了STEP蛋白活性。進(jìn)一步研究表明，化合物E4以時(shí)間依賴性方式抑制一系列PTP，而其較少抑制或沒(méi)有抑制金屬依賴性蛋白磷酸酶。
　　結(jié)論
　　在這里，我們將化合物