一氧化氮在酒精抑制大鼠離體結(jié)腸運動中的介導(dǎo)作用及其機制研究.pdf

1、脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)后，受傷的神經(jīng)組織發(fā)生出血、水腫、神經(jīng)元變性、神經(jīng)細胞凋亡等一系列進行性、自毀性的病理過程，即繼發(fā)性脊髓損傷。繼發(fā)性脊髓損傷的機制存在許多學(xué)說，如：微循環(huán)障礙學(xué)說、氧自由基與脂質(zhì)過氧化學(xué)說、離子內(nèi)環(huán)境學(xué)說、神經(jīng)肽學(xué)說、神經(jīng)營養(yǎng)障礙學(xué)說等，而炎癥免疫反應(yīng)學(xué)說作為繼發(fā)性脊髓損傷的一種機制始終是人們研究和關(guān)注的熱點。 脊髓損傷激發(fā)了劇烈的炎癥免疫反應(yīng)(Inflammatio

2、n)，包括了殘存的神經(jīng)膠質(zhì)細胞的活化，外源炎性細胞(中性粒細胞、單核細胞等)的侵入等。SCI后的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致瘢痕組織形成、神經(jīng)細胞和少突膠質(zhì)細胞的壞死和凋亡，從而阻礙損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。實驗和臨床SCI研究表明直接或間接地抑制SCI后炎癥反應(yīng)可減輕損傷后神經(jīng)功能障礙。迄今為止，SCI后炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的確切機制及其作用尚未完全清楚。進一步了解SCI后的炎癥反應(yīng)的病理生理機制，有益于研發(fā)有效的SCI防治措施和藥物，從而促進SCI后神經(jīng)

3、結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)。 銀杏內(nèi)酯B是銀杏葉提取物的主要活性成分之一，是一類強特異性的血小板活化因子(PAF)拮抗劑。PAF是一種重要的磷脂類的炎性因子，具有促進多核白細胞聚集、趨化、黏附，激活單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞，產(chǎn)生各種細胞因子，增強血管通透性，擴大炎癥反應(yīng)等作用，還可通過促進血栓形成、降低腦血流量、加重腦水腫，影響神經(jīng)細胞功能，參與腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程。研究報告銀杏內(nèi)酯B通過抑制PAF功能而抑制缺血所導(dǎo)致的各

4、類異常炎性反應(yīng)及栓塞形成，抑制自由基的釋出，從而保護脊髓組織免受損傷，因此銀杏內(nèi)酯B既能控制炎癥又可促進神經(jīng)再生。另外銀杏葉提取物來源廣泛且價格低廉，具有較大的實用價值。 本實驗利用54只健康雄性成年Wistar大鼠，隨機分為對照組、損傷組和GB治療組。利用改良的Allen's重物墜落大鼠脊髓損傷模型。對照組僅行椎板切除術(shù)暴露硬脊膜而不損傷脊髓；損傷組分SCI后1d、3d、7d和14d四個時間段，切除椎板暴露且損傷脊髓；GB治療

5、組也分1d、3d、7d和14d四個時間段，在脊髓損傷后即刻按首次劑量2mg/Kg，腹腔注射GB，以后各時間段按2mg/Kg/d劑量分別持續(xù)給藥。對實驗動物進行主動脈灌流并制備石蠟切片，利用免疫組織化學(xué)SP染色法觀察各組大鼠在脊髓損傷后1d、3d、7d和14d的損傷脊髓及其周圍區(qū)星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞和少突膠質(zhì)細胞的形態(tài)、分布及數(shù)量的變化。實驗結(jié)果如下： 1．SCI后不同時間點損傷組和GB治療組星形膠質(zhì)細胞的變化 星

6、形膠質(zhì)細胞除了具有合成和分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，支持和營養(yǎng)神經(jīng)元，促進軸突再生以外，還會形成膠質(zhì)瘢痕，阻礙再生軸突的重建。同時，星形膠質(zhì)細胞還能夠產(chǎn)生眾多的趨化因子和細胞因子，從而參與到對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的免疫防御中去。本實驗采用GFAP單克隆抗體SP免疫染色法特異地顯示星形膠質(zhì)細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對照組GFAP陽性細胞均勻分布在脊髓灰質(zhì)中，GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞呈現(xiàn)為星狀，胞體上有少數(shù)的分支。在SCI后脊髓的損傷區(qū)主要表現(xiàn)細胞壞死，GFAP無表達

7、。損傷組和GB治療組脊髓損傷周圍區(qū)與對照組相比，灰質(zhì)部位GFAP表達都增強，表現(xiàn)為陽性細胞面積增大，數(shù)目增多。GB治療組與損傷組相比，GFAP陽性細胞數(shù)和面積有顯著性減小。SCI后ld時GB治療組、損傷組和對照組損傷脊髓周圍區(qū)GFAP平均陽性細胞數(shù)分別為27.16±1.72、28.17±1.47和19.33±1.75；SCI后3d時分別為31.83±1.94、35.33±1.75和19.00±2.12；SCI后7d時分別為30.50±1

8、.05、34.50±1.76和19.80±1.09；SCI后14d時分別為29.83±1.7、33.17±1.60和19.40±1.51。治療組、損傷組及對照組GFAP平均陽性細胞面積在SCI后ld時分別為23691.33±797.69、23826.50±449.82和21217.83±1278.87； SCI后3d時分別為24109.83±794.47、25424.67±439.95和20714.50±700.61；SCI后7d時為

9、31412.83±947.33、33643.67±898.57和20610.83±445.78；SCI后14d為32414.17±834.47、36118.83±918.74和20617.83±422.66。以上數(shù)據(jù)顯示，與對照組相比，損傷組和GB治療組在SCI后1d、3d、7d和14d GFAP平均陽性細胞數(shù)和面積都有非常顯著性增加(p<0.01)；而GB治療組在SCI后3d、7d和14d GFAP平均陽性細胞數(shù)和陽性細胞面積較損傷組

10、非常顯著性減小(p<0.01)。提示SCI后應(yīng)用GB可以有效地減少星形膠質(zhì)細胞的增生和肥大。 2．SCI后不同時間點損傷組和GB治療組小膠質(zhì)細胞的變化小膠質(zhì)細胞是CNS中常駐的巨噬細胞。研究發(fā)現(xiàn)，活化的小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞可能具有雙重作用，一方面釋放促炎性細胞因子，進一步導(dǎo)致組織損害；另一方面可產(chǎn)生多種神經(jīng)存活和組織修復(fù)所需的生長因子，有益于損傷組織的修復(fù)。本實驗采用EDl單克隆抗體SP免疫染色法特異地顯示活化的小膠質(zhì)細胞/巨噬

11、細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對照組大鼠脊髓EDl陽性細胞含量極少，細胞體積小、呈圓點和細長狀態(tài)，染色較淺。在SCI后脊髓的損傷區(qū)主要表現(xiàn)為細胞壞死，EDl基本無表達。在損傷組和治療組損傷脊髓周圍區(qū)SCI后EDl平均陽性細胞數(shù)量增加、體積增大，并出現(xiàn)小突起(偽足)表現(xiàn)出活化巨噬細胞的形態(tài)特征。GB治療組EDl平均陽性細胞數(shù)較損傷組非常顯著性減少。GB治療組和損傷組脊髓損傷周圍區(qū)與對照組相比，EDl平均陽性細胞數(shù)在SCI后1d時分別為18.00±0.8

12、9、19.33±1.51、12.17±0.75；SCI后3d時分別為24.67±1.03、28.00±1.41、11.83±1.17：SCI后7d時分別為20.33±1.21、22.17±1.47、12.33±1.2l；SCI后14d時分別為17.33±1.37、19.33±1.03、12.67±1.21。以上數(shù)據(jù)顯示，與對照組相比，損傷組和GB治療組在SCI后1d、3d、7d和14d EDl平均陽性細胞數(shù)都非常顯著性增加(p<0.01

13、)；GB治療組在SCI后3d、7d和14dEDl平均陽性細胞數(shù)較損傷組顯著性減少(3d p<0.01；7d和14dp<0.05)。提示GB能減少巨噬細胞向損傷脊髓炎癥反應(yīng)區(qū)募集、減少小膠質(zhì)細胞的活化，從而減輕炎癥反應(yīng)。 3．SCI后不同時間點損傷組和GB治療組少突膠質(zhì)細胞和髓鞘的變化 少突膠質(zhì)細胞的主要功能是形成中樞神經(jīng)纖維髓鞘，另外還具有類似星形膠質(zhì)細胞攝取神經(jīng)遞質(zhì)(如γ-氨基酸等)、參與損傷神經(jīng)的吞噬活動，并能在其

14、成熟和形成髓鞘過程中抑制神經(jīng)元突起的再生。本實驗采用MBP單克隆抗體SP免疫染色法特異地顯示髓鞘。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：由MBP抗體標記的髓鞘呈棕褐色。正常對照組脊髓白質(zhì)內(nèi)MBP染色強，呈規(guī)整網(wǎng)格樣結(jié)構(gòu)，高倍鏡下可以見單根軸突周圍的髓鞘縱斷面為連續(xù)或不連續(xù)的條索狀，而橫斷面為環(huán)形或半環(huán)形，軸索位于中心，形成同心圓結(jié)構(gòu)。在SCI后1d、3d、7d和14d治療組和損傷組周圍區(qū)MBP陽性細胞與對照組相比著色都變淺，SCI后1d時治療組、損傷組及對照組MB

15、P平均陽性細胞面積分別為35406.83±587.68、31431.83±673.63、39455.00±524.88，SCI后3d時分別為32073.50±577.06、30132.00±777.70、39711.33±755.84，SCI后7d時分別為30313.83±714.89、29301.17±591.79、40162.83±822.78，SCI后14d時分別為29724.00±735.61、28293.33士645.63、3

16、9764.67±578.29。以上數(shù)據(jù)顯示SCI后MBP平均陽性面積非常顯著性地較對照組減小(p<0.01)，提示SCI后形成髓鞘的少突膠質(zhì)細胞受到破壞。GB治療后MBP陽性髓鞘面積非常顯著性升高(p<0.01)，提示GB可在一定程度上防止損傷脊髓神經(jīng)軸突脫髓鞘并具有促進髓鞘再生的作用。 4．SCI后不同時間點損傷組和GB治療組S100β的變化 在哺乳動物的中樞神經(jīng)組織中，S100蛋白(S100-protein)主要

17、定位于膠質(zhì)細胞，特別是星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。CNS內(nèi)活化的膠質(zhì)細胞主要分泌S100β，它是S100蛋白家族中最具活性的成分，是介導(dǎo)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元之間相互作用的橋梁。本實驗采用S100β單克隆抗體SP免疫染色法特異地顯示S100β陽性細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常脊髓組織S100β陽性細胞數(shù)量較少，染色較淺。在SCI后脊髓的損傷區(qū)主要表現(xiàn)為細胞壞死，S100β基本無表達。在損傷組和治療組脊髓損傷周圍區(qū)SCI后S100β陽性細胞數(shù)量增加、體積

18、增大。治療組與損傷組相比，S100β陽性細胞數(shù)則明顯減少。GB治療組、損傷組脊髓損傷周圍區(qū)與對照組S100β平均陽性細胞數(shù)在SCI后1d時分別為13.50±0.55、14.83±1.16、10.50±1.05；SCI后3d時分別為21.33±1.03、25.50±1.04、10.33±1.37；SCI后7d時分別為18.00±0.89、21.33±0.82、9.83±1.16；SCI后14d時分別為15.33±1.21、17.83±1.

19、17、10.17±0.75。以上數(shù)據(jù)顯示SCI后1d、3d、7d和14d S100β平均陽性細胞數(shù)非常顯著性地較對照組增加(p<0.01)，GB治療組SCI后3d、7d和14dS100β平均陽性細胞數(shù)較損傷組非常顯著減少(p<0.01)，提示GB對SCI后膠質(zhì)細胞有保護作用。 綜上所述，本實驗可得出如下結(jié)論：(1)實驗性大鼠急性SCI后，在損傷脊髓可引起星形膠質(zhì)細胞的增生、活化和增殖，EDl炎性吞噬細胞和小膠質(zhì)細胞的活化，以及少