外源性一氧化氮對(duì)大鼠慢性胃潰瘍的保護(hù)作用及其機(jī)制.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 外源性一氧化氮對(duì)大鼠慢性胃潰瘍的保護(hù)作用
　　目的:
　　迷走神經(jīng)在胃腸道炎癥發(fā)生時(shí)通過(guò)膽堿能抗炎癥反射（Cholinergic anti-inflammation reflex，CAIF），又稱(chēng)炎癥反射(Inflammation Reflex)調(diào)節(jié)和控制免疫反應(yīng)，抑制炎癥水平，但在胃腸道發(fā)生炎癥時(shí)局部迷走神經(jīng)末梢被激活的傳入通路尚不清楚。多項(xiàng)研究表明NO在胃潰瘍的發(fā)生中發(fā)

2、揮保護(hù)作用，但機(jī)制尚不明確。有研究提示一氧化氮能夠間接激活消化道迷走神經(jīng)末梢，然而尚沒(méi)有直接證據(jù)表明其參與膽堿能抗炎反射。本研究的目的是證實(shí)外源性一氧化氮對(duì)胃潰瘍的保護(hù)作用是直接激活迷走神經(jīng)，同時(shí)探索其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　通過(guò)胃壁漿膜下注射冰醋酸的方法誘導(dǎo)大鼠慢性胃潰瘍模型。通過(guò)腹膜腔注射N(xiāo)O外源性供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP），或者預(yù)先膈下迷走神經(jīng)切除術(shù)后腹膜腔注射SNP，或者聯(lián)合

3、注射SNP及TRPV1通道阻斷劑(capsazepine，CZP)干預(yù)潰瘍的形成。術(shù)后第四天處死動(dòng)物通過(guò)測(cè)量潰瘍面積、組織切片HE染色、組織髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性檢測(cè)等方法評(píng)估炎癥水平。
　　結(jié)果:
　　1.SNP對(duì)潰瘍面積、宏觀形態(tài)的影響
　　腹膜腔注射SNP對(duì)胃黏膜組織的充血、水腫及潰瘍形成有明顯改善作用，潰瘍面積明顯減小，由1.16±0.12mm2減小到0.74±0.12mm2

4、(P＜0.05，n=6)，同時(shí)注射CZP、或膈下迷走神經(jīng)切斷術(shù)后，SNP的作用消失。
　　2.SNP對(duì)胃組織組織學(xué)表現(xiàn)的影響
　　冰醋酸對(duì)照組可見(jiàn)胃黏膜下層結(jié)構(gòu)破壞，出血及滲出，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。腹膜腔注射SNP后炎癥表現(xiàn)明顯減輕，同時(shí)注射CZP、或膈下迷走神經(jīng)切斷術(shù)后，SNP的作用消失。
　　3.SNP對(duì)胃組織內(nèi)MPO活性的影響
　　冰醋酸對(duì)照組大鼠胃組織的MPO活性比生理鹽水對(duì)照組明顯增高(1.79±0.37U/

5、g vs0.23±0.05U/g，P＜0.05，n=6)。經(jīng)SNP連續(xù)腹膜腔注射4天后，胃的MPO活性顯著降低(P＜0.05，n=6)。同時(shí)注射CZP、或膈下迷走神經(jīng)切斷術(shù)后，SNP的作用消失。
　　結(jié)論:
　　外源性NO對(duì)冰醋酸誘導(dǎo)的大鼠慢性胃潰瘍的發(fā)生發(fā)展起到保護(hù)作用，這種作用是通過(guò)迷走神經(jīng)實(shí)現(xiàn)的，提示NO可能參與迷走神經(jīng)抗炎反射的傳入通路，并且TRPV1通道可能參與這個(gè)過(guò)程。
　　第二部分 外源性一氧化氮對(duì)大鼠腸

6、系膜傳入神經(jīng)放電的影響及其機(jī)制
　　目的:
　　本研究的目的是探索外源性一氧化氮對(duì)腸系膜傳入神經(jīng)放電的直接作用及其機(jī)制，以期揭示NO在傳入神經(jīng)水平的抗炎作用機(jī)制。
　　方法:
　　利用離體腸系膜傳入神經(jīng)電活動(dòng)記錄分析技術(shù)記錄SNP對(duì)離體雄性大鼠、小鼠和TRPV1-/-小鼠空腸傳入神經(jīng)生物電活動(dòng)的影響，并用單信號(hào)分析(Single Unit Analysis)方法分析其對(duì)不同類(lèi)型神經(jīng)纖維的作用。并分別用膈下迷走神經(jīng)

7、切斷術(shù)、巰基保護(hù)劑N-ethylmaleimide(NEM)、選擇性GC阻斷劑1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one(ODQ)、TRPV1阻斷劑CZP研究SNP的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.NO供體SNP對(duì)大鼠腸系膜傳入神經(jīng)自發(fā)放電的影響
　　待神經(jīng)放電穩(wěn)定后，向腸段漿膜面加入4mM的SNP，2min內(nèi)腸系膜傳入神經(jīng)放電頻率明顯增加，放電頻率差值從1.3±1.2imp

8、/s增加到48.5±7.3imp/s(P＜0.05，n=6)，而低濃度(0.01mM)的SNP對(duì)自發(fā)放電并沒(méi)有顯著作用(P＞0.05，2=6)，SNP的作用表現(xiàn)出濃度依賴(lài)性，半數(shù)有效率ED50為0.16mM。
　　2.NO供體SNP對(duì)傳入神經(jīng)中不同神經(jīng)成分的自發(fā)放電的影響
　　用單信號(hào)分析(single-unit analysis)的方法，分析到59個(gè)機(jī)械敏感性傳入神經(jīng)放電信號(hào)。其中17個(gè)信號(hào)發(fā)自低閾值神經(jīng)纖維，一般認(rèn)為這類(lèi)

9、纖維為迷走傳入纖維;20個(gè)信號(hào)發(fā)自高閾值神經(jīng)纖維，一般認(rèn)為這類(lèi)纖維為脊神經(jīng)中的內(nèi)臟痛覺(jué)傳入纖維;其余22個(gè)信號(hào)發(fā)自寬閾值神經(jīng)纖維。SNP增加了低閾值神經(jīng)纖維的自發(fā)放電水平(P＜0.05)，但對(duì)高閾值的纖維成分沒(méi)有影響。
　　3.膈下迷走神經(jīng)切斷術(shù)對(duì)SNP作用的影響
　　大鼠在麻醉狀態(tài)下行膈下迷走神經(jīng)切斷術(shù)，14天后犧牲動(dòng)物，取出空腸，用含0.16mM SNP的柯氏液預(yù)孵育后，迷走神經(jīng)切斷手術(shù)組的大鼠傳入神經(jīng)放電頻率增加值降低

10、到2.6±0.4imp/s，明顯低于假手術(shù)組(26.9±5.2imp/s，P＜0.01，n=6)。
　　4.巰基保護(hù)劑及選擇性GC阻斷劑對(duì)SNP作用的影響
　　在器官浴槽中加入NEM(5mM)預(yù)孵育15min后，SNP不再引起腸系膜傳入神經(jīng)自發(fā)放電的增加，NEM組加入SNP后放電頻率增加值比DMSO組明顯降低，從23.4±5.2imp/s降至0.2±5.7imp/s（P＜0.05，n=6）;然而ODQ(10μM)預(yù)孵育10m

11、in并不影響SNP的作用（P=0.52，n=6）。
　　5.TRPV1通道阻斷劑、基因敲除對(duì)SNP作用的影響及SNP對(duì)辣椒素敏感性的影響
　　空腸標(biāo)本用含CZP(50μM)的柯氏液預(yù)孵育10min后，SNP誘發(fā)放電增加較DMSO對(duì)照組明顯降低，從25.8±5.6imp/s降至8.4±4.1imp/s(P＜0.05，n=6)。SNP和辣椒素具有明顯的協(xié)同作用，兩者共同作用所引起的傳入神經(jīng)放電頻率增加值從8.2±1.8imp/s

12、（辣椒素的單獨(dú)作用）增加至20.9±2.7imp/s(P＜0.05，n=6)。SNP對(duì)TRPV1基因敲除小鼠腸系膜傳入神經(jīng)放電的作用遠(yuǎn)低于野性型小鼠（P＜0.001，n=6）。
　　結(jié)論:
　　SNP通過(guò)激活大鼠空腸腸系膜傳入神經(jīng)中的迷走神經(jīng)纖維末梢，上調(diào)其自發(fā)放電的頻率，該作用主要是通過(guò)巰基亞硝基化作用實(shí)現(xiàn)的，TRPV1通道參與了這一過(guò)程。
　　第三部分 外源性一氧化氮對(duì)大鼠結(jié)狀神經(jīng)節(jié)和背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元電活動(dòng)的影響及

13、其機(jī)制
　　目的:
　　前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)SNP通過(guò)巰基亞硝基化作用激活腸系膜迷走神經(jīng)傳入纖維，且在這個(gè)過(guò)程中有TRPV1通道的參與。為了進(jìn)一步證實(shí)SNP對(duì)迷走神經(jīng)的選擇性激活作用，并驗(yàn)證TRPV1是巰基亞硝基化的靶點(diǎn)，在神經(jīng)元水平進(jìn)行電生理實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究SNP的作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　分離大鼠結(jié)狀神經(jīng)節(jié)（nodose ganglion，NG）、T7-L5節(jié)段的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root gangli

14、on，DRG)，消化分離出單個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞后接種于玻片上。利用全細(xì)胞膜片鉗記錄神經(jīng)元細(xì)胞靜息膜電位、辣椒素(capsaicin，CAP)激發(fā)膜電流，電信號(hào)通過(guò)Axon膜片鉗放大器和A/D轉(zhuǎn)換器記錄入計(jì)算機(jī)，使用Clampex10.2軟件進(jìn)行信號(hào)采集和分析。
　　結(jié)果:
　　1.NO供體SNP對(duì)NG神經(jīng)元細(xì)胞靜息膜電位的影響
　　NG細(xì)胞的靜息膜電位為-57.4±1.3mV(n=43)。SNP(0.16mM)使NG細(xì)胞膜發(fā)

15、生明顯去級(jí)化(P＜0.05，n=7)，經(jīng)細(xì)胞外液沖洗可部分恢復(fù)，低濃度的SNP(0.016mM)不影響NG神經(jīng)元的膜電位。
　　2.巰基保護(hù)劑及選擇性GC阻斷劑對(duì)SNP作用的影響
　　用含巰基保護(hù)劑NEM(5mM)的細(xì)胞外液孵育NG細(xì)胞15min后，SNP引起膜去極化的作用明顯減低（P＜0.01，n-7）。然而選擇性GC阻斷劑ODQ(10μM)預(yù)孵育10min并不影響SNP的作用。
　　3.TRPV1通道阻斷劑對(duì)SNP

16、作用的影響
　　用TRPV1阻斷劑CZP(50μM)孵育NG細(xì)胞10min后，SNP引起膜去極化的作用明顯減低(P＜0.05，n=7)。
　　4.SNP對(duì)NG神經(jīng)元細(xì)胞辣椒素電流的影響
　　SNP(0.16mM)顯著增加NG細(xì)胞中辣椒素誘發(fā)的內(nèi)向電流(capsaicin-induced inward current，Icap)的幅度，電流峰值從-609.4±88.0pA增加至-1224.3±202.1pA（P＜0.05

17、，n=7）。NEM(5mM)孵育顯著降低SNP的作用，而ODQ(10μM)對(duì)其沒(méi)有明顯影響。
　　5.SNP對(duì)DRG神經(jīng)元細(xì)胞靜息膜電位的影響
　　SNP（0.0016-0.16mM）使DRG細(xì)胞膜電位發(fā)生超級(jí)化(P＜0.05，n=7)，經(jīng)細(xì)胞外液沖洗可恢復(fù)至靜息膜電位水平，呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。
　　結(jié)論:
　　SNP能夠通過(guò)巰基亞硝基化作用激活NG神經(jīng)元上的TRPV1通道，并提高神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)辣椒素的化學(xué)敏感性，提示