冠心病患者外周血輔助性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化的研究.pdf

1、目的：不同的T細(xì)胞亞群在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展過(guò)程中起不同的作用。輔助性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中起完全相反的作用。為了明確1型輔助性T細(xì)胞和新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞亞群在冠心病患者疾病發(fā)展中的作用，我們分析了冠心病患者和健康對(duì)照組外周血中1型輔助性T細(xì)胞和CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞與冠心病進(jìn)展之間的關(guān)系。 方法： 1）研究對(duì)象及外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離。本實(shí)驗(yàn)共選取了5

2、8名冠心病患者（穩(wěn)定性心絞痛組18例，不穩(wěn)定性心絞痛組16例，心肌梗死組24例）和健康對(duì)照組12例。研究對(duì)象入選后即抽取外周靜脈血，經(jīng)密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞。 2）流式細(xì)胞分析法分析外周血1型和2型輔助性T細(xì)胞。標(biāo)本單個(gè)核細(xì)胞在37°C/5％ CO2由刺激劑刺激4小時(shí)。刺激后的標(biāo)本進(jìn)行膜表面分子CD3的熒光染色。破膜后進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的免疫熒光染色。染色完畢，將標(biāo)本進(jìn)行流式細(xì)胞分析。結(jié)果表示為CD3+T

3、細(xì)胞亞群中細(xì)胞因子染色陽(yáng)性的細(xì)胞百分比。 3）ELISA法檢測(cè)研究對(duì)象外周血漿中的IFN-γ，IL-2，IL-10和IL-4的濃度。標(biāo)本抗凝后立即離心，收集血漿立即保存于–80°C。檢測(cè)時(shí)復(fù)融，應(yīng)用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)標(biāo)本中的細(xì)胞因子濃度。 4）流式細(xì)胞分析法分析外周CD4+CD25+Foxp3+T 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。將研究對(duì)象外周血單個(gè)核細(xì)胞在染色緩沖液中重懸，應(yīng)用人體調(diào)節(jié)性T細(xì)胞流式染色試劑盒進(jìn)行染色。染色完成后進(jìn)行

4、流式細(xì)胞儀分析，將CD4+CD25+T細(xì)胞亞群中檢測(cè)6000個(gè)細(xì)胞。結(jié)果表示為其中Foxp3陽(yáng)性的細(xì)胞百分比。 5）CD4+CD25+T細(xì)胞的分選和rt-PCR檢測(cè)其Foxp3的表達(dá)。應(yīng)用CD4+CD25+免疫磁珠分選試劑盒分選CD4+CD25+T細(xì)胞，分選后的細(xì)胞的純度由流式細(xì)胞儀驗(yàn)證。應(yīng)用rt-PCR的方法檢測(cè)分選細(xì)胞亞群Foxp3的表達(dá)。 結(jié)果： 1）研究對(duì)象的一般信息。健康對(duì)照組，穩(wěn)定性心絞痛組，不穩(wěn)定性

5、心絞痛組，心肌梗死組在年齡，性別，血脂，血糖，高血壓和吸煙等危險(xiǎn)因素方面都無(wú)明顯差異。 2）各組CD3+T細(xì)胞亞群中1型和2型輔助性T細(xì)胞的頻率。健康對(duì)照組Th1細(xì)胞百分比為6.81±1.43％，SA組Th1細(xì)胞百分比為5.91±0.92％，UA組Th1細(xì)胞百分比為19.71±5.14％，MI組Th1細(xì)胞百分比為29.40±5.81％。ACS（UA組與MI組）患者Th1細(xì)胞百分比較SA和健康對(duì)照組明顯升高，（P<0.001），M

6、I組Th1細(xì)胞百分比較UA組亦有明顯升高（P<0.01），而SA組與健康對(duì)照組之間并無(wú)明顯差異（P>0.05）。健康對(duì)照組Th2細(xì)胞百分比為0.79±0.19％，SA組Th2細(xì)胞百分比為0.79±0.25％，UA組Th2細(xì)胞百分比為0.69±0.22％，MI組Th2細(xì)胞百分比為0.73±0.21％。各組之間并無(wú)明顯差異（P>0.05）。 3）各組外周血1型和2型輔助性T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的濃度。健康對(duì)照組IFN-γ血漿濃度為42.

7、71±12.58 pg/ml ， SA 組為47.56±20.21 pg/ml ， UA 組為125.84±41.14 pg/ml，MI組為134.74±43.34 pg/ml。ACS（UA組和MI組）患者較SA組和健康對(duì)照組IFN-γ水平明顯升高（P<0.001）。ACS兩個(gè)亞組之間無(wú)顯著性差異，SA組與健康對(duì)照組亦無(wú)顯著性差異（P>0.05）。健康對(duì)照組IL-2血漿濃度為50.48±20.06pg/ml ， SA 組為46.21±1

8、6.72pg/ml ， UA 組為77.31±26.40pg/ml，MI組為87.93±16.40pg/ml。ACS（UA組和MI組）患者較SA組和健康對(duì)照組IL-2水平明顯升高（P<0.001）。ACS兩個(gè)亞組之間無(wú)顯著性差異，SA組與健康對(duì)照組亦無(wú)顯著性差異（P>0.05）。健康對(duì)照組IL-10血漿濃度為35.99±5.64pg/ml ， SA 組為27.51±5.53pg/m ， UA 組為19.11±3.53pg/ml，MI組為

9、15.14±4.06pg/ml。冠心病患者血漿中IL-10水平逐漸下降，各組之間均有顯著差異（P<0.001）。所有研究對(duì)象血漿IL-4水平均低于試劑盒的檢測(cè)下限。 4）各組CD4+CD25+T細(xì)胞亞群中Foxp3+T細(xì)胞的頻率。CD4+CD25+T細(xì)胞亞群在PBMC中的比例在健康對(duì)照組和冠心病患者中無(wú)明顯變化，健康對(duì)照組為6.80±1.15％，SA組為6.33±1.39％，UA組為6.57±1.24％，MI組中為6.93±1.

10、16％，各組之間P>0.05。Foxp3+T細(xì)胞在CD4+CD25+T細(xì)胞亞群中的比例在健康對(duì)照組中為84.78±6.15％，在SA組中為71.75±8.05％，在UA組中為51.77±7.07％，在MI組中為40.43±5.73％。Foxp3+T細(xì)胞的比例在冠心病患者中相對(duì)于健康對(duì)照組明顯降低，P＜0.001，并且隨著冠心病的進(jìn)展逐漸降低，SA組、UA組和MI組之間均有明顯差異，P＜0.001。 5）各組CD4+CD25+T細(xì)

11、胞亞群中Foxp3mRNA的表達(dá)。Foxp3和β-actin的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離后，均只有一條帶，與預(yù)期長(zhǎng)度相吻合，說(shuō)明均為特異性擴(kuò)增片段。對(duì)瓊脂糖凝膠電泳圖譜上基因條帶進(jìn)行圖像分析，計(jì)算Foxp3和β-actin吸收峰面積比值，健康對(duì)照組為0.925±0.045，SA組為0.730±0.053，UA組為0.577±0.054，MI組為0.350±0.078，各組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.001。 結(jié)